目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染導致的肝硬化和肝細胞癌等相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率持續(xù)增加,并且HBV感染傳播途徑多,發(fā)病過程長,發(fā)病機制復雜,對人類健康早已產(chǎn)生了嚴重威脅~([1])。目前,抗HBV的藥物主要有干擾素(interferon,IFN)和核苷(酸)類似物[necleoside(acid)analogues,Nas]。這兩類藥物雖能抑制HBV復制,但不能徹底清除肝細胞核內(nèi)共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA),且長期服用會產(chǎn)生毒副作用和耐藥性,所以很難達到理想的治療目的~([2])。因此尋找安全高效的治療藥是目前相關(guān)科研者的共同目標,我們課題組設(shè)計了新型核苷類化合物GY001-GY005。本課題旨在對GY001-GY005這五個化合物進行抗HBV活性篩選,針對活性較好的化合物對其抗HBV機制進行探索,并進行了大鼠血漿中代謝物鑒定實驗,為化合物非臨床藥代動力學提供數(shù)據(jù)支持。方法:本課題采用人肝癌HepG2細胞、野生型轉(zhuǎn)染HBV基因的HepG2.2.15細胞和對拉米夫定耐藥HBV基因的HepGRL1細胞為篩選模型,選用濃度為20μM的拉米夫定(3TC)作為陽性藥~([3])。以HBsAg和HBeAg為指標對這5個化合物進行體外抗HBV活性比較,并檢測其對細胞上清液及細胞內(nèi)HBV DNA拷貝數(shù)的影響,選出活性最好的化合物探討其抗HBV機制。在此基礎(chǔ)上,對活性最好的化合物GY005進行大鼠血漿中代謝物鑒定實驗,為此類化合物后期的藥代動力學實驗奠定基礎(chǔ)。本研究共分三部分,其內(nèi)容如下:第一部分化合物GY001-GY005體外抗HBV活性研究通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色分析法檢測化合物對HepG2細胞的毒性,計算半數(shù)細胞毒性濃度(CC_(50));酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測藥物作用于細胞6天后上清中的HBsAg、HBeAg的變化,比較5個化合物對HBV抗原表達量的抑制作用;實時熒光定量聚合酶鏈反應法(Quantitative Real-time PCR,FQ-PCR)檢測化合物作用于細胞6天后,化合物對細胞內(nèi)及細胞上清中HBV DNA拷貝數(shù)的影響,計算出化合物對HepG2.2.15細胞和HepGRL1細胞上清中及細胞內(nèi)HBV DNA拷貝數(shù)的抑制率,再與陽性藥物抑制率比較,判斷其體外抗HBV效果。第二部分GY005抗HBV作用機制研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法(Reverse Tanscription PCR,RT-PCR)檢測GY005對HepG2.2.15細胞HBV聚合酶(Polymerase,P)基因mRNA表達活性的影響。HepG2.2.15細胞培養(yǎng)于6孔細胞板,設(shè)定給藥組、陽性組和空白組,6天后收集細胞并提取RNA,反轉(zhuǎn)錄后進行RT-PCR,最后對PCR產(chǎn)物進行圖像采集并進行半定量分析。第三部分GY005大鼠血漿中代謝物初步鑒定選取SD大鼠,GY005用CMC-Na勻漿,灌胃給藥后眼眶采血,分離血漿,通過LC-MS/MS檢測其代謝物,對數(shù)據(jù)分析并與標準品進行比較,從而初步確定代謝物。結(jié)果:1.通過MTT法檢測,GY001-GY005體外對HepG2細胞的毒性均較小,其CC_(50)均大于500μM。2.ELISA法檢測同濃度(1μM)的GY001-GY005對HepG2.2.15和HepGRL1細胞抗原的抑制率,結(jié)果顯示GY001-GY005對HBV抗原的分泌均有抑制作用,其中GY005活性稍好。3.FQ-PCR法結(jié)果顯示,GY001-GY005均能顯著降低細胞上清液和細胞內(nèi)HBV DNA水平,且對其拷貝數(shù)的抑制率均呈濃度依賴性。對HepG2.2.15細胞給藥6天,GY005活性較為突出,1μM的GY005對HepG2.2.15細胞上清和胞內(nèi)HBV DNA的抑制率分別為81.07%(p0.01)、71.85%(p0.01),3TC組對其抑制率約為75%;對HepGRL1細胞給藥6天,作用最突出的依然是GY005,1μM的GY005對HepGRL1細胞上清和胞內(nèi)HBV DNA的抑制率分別高達72.97%(p0.01)、80.05%(p0.01),3TC組對其抑制率約為20%。4.RT-PCR檢測結(jié)果表明,與空白對照組和陽性對照組相比,經(jīng)GY005作用之后的細胞內(nèi)HBV P基因mRNA條帶亮度顯著降低。說明GY005可抑制HBV-P基因mRNA的表達。5.LC-MS/MS檢測結(jié)果表明,大鼠灌胃給藥GY005 2h后體內(nèi)代謝物有GY001、GY002以及GY003,含量都比較少,而原型(GY005)基本完全水解。結(jié)論:1.GY001-GY005化合物毒性均較小。2.GY001-GY005化合物具有明顯的抗HBV的作用,其中活性最好的是GY005,其作用機制為轉(zhuǎn)錄水平抑制HBV P基因mRNA的表達。3.GY005在大鼠體內(nèi)易水解,水解代謝物有GY001、GY002和GY003。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

從以上幾個方面進行 GY001-GY 和轉(zhuǎn)染人野生型 HBV 病毒 He存。轉(zhuǎn)染人拉米夫定耐藥型 HB王慶端研究員構(gòu)建和保存。005 由河南省科學院高新技術(shù)研03 和 GY005 用 DMSO 溶解至 1（DMSO:H2O=1:1）溶解至 100

16圖 1.2 GY001-GY005 作用 HepG2.2.15 細胞 6 天對 HBV DNA 的抑制作用（與空白對照組相比,*P < 0.05,**P < 0.01,與陽性對照組相比,&P < 0.05,□P < 0.01

圖 2.1 HBV P 基因 mRNART-PCR 電泳結(jié)果圖M：DNA Marker1a 和 1b：3TC + GAPDH2a 和 2b：Control + GAPDH3a 和 3b：GY005 + GAPDH GY005 在 HepG2.2.15 細胞培養(yǎng)中對 HBV P 基因 mRNA 影響（X＿±S，Groups Concentration（μM） HBV P gene/ GAPDControl / 0.56±0.383TC 20 0.37±0.05*GY005 1 0.29±0.14*照組，*P < 0.01
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本文編號：2854402