研究目的:環(huán)境重金屬污染已成為嚴重影響人群健康的公共衛(wèi)生問題,其中鉛(Lead,Pb)、鎘(Cadmium,Cd)和汞(Mercury,Hg)暴露所造成的健康危害較為嚴重,這些重金屬通常共存于人類生活環(huán)境中,早期接觸可致兒童認知功能發(fā)育不良。已有研究發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境干預可提高認知能力,那么豐富環(huán)境干預是否對重金屬混合暴露所致的認知損傷有所改善?可能的分子機制又如何?本研究通過飲用水暴露Pb、Cd和Hg三種重金屬混合物,分別建立生命早期(胚胎至斷乳前)和持續(xù)(胚胎至成年)重金屬混合染毒以及豐富環(huán)境干預Sprague Dawley(SD)大鼠模型,探索豐富環(huán)境干預對Pb、Cd和Hg三種重金屬混合暴露所致大鼠認知損傷的改善作用及其可能的機制,為進一步深入研究重金屬污染物的神經(jīng)毒性損傷改善提供科學依據(jù)。研究方法:1.動物模型建立:9周齡性成熟無特定病原體級(Specific pathogen free,SPF)大鼠,按雄鼠:雌鼠=1:2的比例合籠配對,將受孕成功的雌性大鼠隨機分至對照組(僅飲用去離子水)、持續(xù)暴露組(仔鼠在胚胎和斷乳前通過母鼠飲用含有250mg/L的三水乙酸鉛、75mg/L的氯化鎘和1.5mg/L的氯化汞混合液染毒,在斷乳后飲用含有83.333mg/L的三水乙酸鉛、10mg/L的氯化鎘和0.5mg/L的氯化汞混合染毒液直至成年)、斷乳前暴露組(仔鼠在胚胎和斷乳前通過母鼠飲用含有250mg/L的三水乙酸鉛、75mg/L的氯化鎘和1.5mg/L的氯化汞混合液染毒,在斷乳后僅飲用去離子水)和豐富環(huán)境干預組(仔鼠在胚胎和斷乳前通過母鼠飲用與斷乳前暴露組相同濃度的Pb、Cd、Hg混合液染毒,在斷乳后則飲用去離子水,并從出生后第1天開始給予豐富環(huán)境干預刺激,直至成年)。2.全血和腦組織中重金屬含量測定:采用微波消解對全血及大腦組織進行消解。通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)檢測大鼠全血及腦組織中Pb和Cd的含量,冷蒸汽原子熒光光譜法(cold vapor atomic fluorescence spectrometry,CV-AFS)檢測全血及腦組織中Hg的含量。3.神經(jīng)行為學檢測:通過Morris水迷宮試驗檢測大鼠的空間學習記憶能力;通過八臂迷宮試驗檢測大鼠的工作記憶能力。4.樹突棘、神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)檢測:通過Golgi-Cox染色觀察大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)以及前額葉皮層(PFC區(qū))的樹突棘密度及類型變化;用透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)突觸超微結(jié)構(gòu)改變。5.Snk、SPAR m RNA及蛋白表達檢測:通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)檢測大鼠海馬血清誘導激酶(Serum-inducible kinase,Snk)以及樹突棘相關(guān)Rap-特異性GTPase-活化蛋白(Spine-associated Rap guanosinetriphosphatase activating protein,SPAR)的m RNA表達改變;通過免疫熒光和激光共聚焦技術(shù)以及蛋白免疫印跡技術(shù)(Western Blot)檢測大鼠海馬Snk、SPAR蛋白表達改變。6.海馬神經(jīng)元損傷情況:應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元細胞核及細胞器的損傷,同時通過流式細胞術(shù)測定大鼠海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)活性氧水平和細胞凋亡水平以分析大鼠海馬神經(jīng)元的損傷情況。研究結(jié)果:1.豐富環(huán)境對Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠全血及腦組織中重金屬含量影響。ICP-MS和CV-AFS的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),持續(xù)Pb、Cd、Hg混合暴露的大鼠全血及腦組織中三種重金屬含量均高于對照組(P0.05),而豐富環(huán)境組和斷乳前暴露組大鼠全血及腦中除Pb均未檢出外,Cd和Hg的含量均低于持續(xù)暴露組(P0.05),且都高于對照組(P0.05)。2.豐富環(huán)境對Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠認知行為的影響。Morris水迷宮和八臂迷宮試驗發(fā)現(xiàn),豐富環(huán)境改善了Pb、Cd、Hg混合暴露所致大鼠空間學習記憶以及工作記憶損傷:在Morris水迷宮測試中發(fā)現(xiàn),持續(xù)暴露組和斷乳前暴露組大鼠尋找平臺的逃避潛伏期明顯高于對照組(P0.05),而豐富環(huán)境干預組大鼠的逃避潛伏期明顯低于斷乳前暴露組(P0.01),而與對照組逃避潛伏期相比,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在八臂迷宮測試中,持續(xù)暴露組和斷乳前暴露組大鼠尋找食物的潛伏期明顯高于對照組(P0.01),而豐富環(huán)境干預組大鼠的潛伏期明顯低于斷乳后自然恢復的斷乳前暴露組(P0.01),與對照組潛伏期相比,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.豐富環(huán)境對Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠樹突棘形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。通過Golgi-Cox染色發(fā)現(xiàn),豐富環(huán)境改善了Pb、Cd、Hg混合暴露所致大鼠腦組織樹突棘密度減少。持續(xù)暴露組和斷乳前暴露組的大鼠海馬各區(qū)域的樹突棘密度均低于對照組(P0.01),且持續(xù)暴露組的大鼠海馬CA1、DG區(qū)和PFC區(qū)樹突棘密度低于斷乳前暴露組(P0.01),而豐富環(huán)境干預組和斷乳前暴露組(斷乳后自然恢復)的大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)以及皮層PFC區(qū)樹突棘密度相對于持續(xù)暴露組有所增加,但尚未增加到對照組水平(斷乳前暴露組分別增加到對照組的91.38%、85.33%、84.46%和81.31%,豐富環(huán)境干預組分別增加到對照組的93.85%、89.16%、81.72%和94.32%),而且豐富環(huán)境干預組CA1、CA3和PFC區(qū)的樹突棘密度相比于未進行干預的斷乳前暴露組分別增加了約2.71%、4.49%和16.01%。此外,豐富環(huán)境改善了Pb、Cd、Hg混合暴露所影響的大鼠樹突棘類型,但并沒有恢復至對照組水平。持續(xù)暴露組和斷乳前暴露組的海馬CA1、CA3區(qū)和皮層PFC區(qū)的蘑菇型樹突棘比例低于對照組(P0.05);而豐富環(huán)境干預組和斷乳前暴露組(斷乳后自然恢復)的海馬各區(qū)蘑菇型樹突棘比例較持續(xù)暴露組均有所增加;此外,豐富環(huán)境干預組海馬CA1區(qū)蘑菇型樹突棘比例高于斷乳前暴露組(P0.05)、PFC區(qū)蘑菇型樹突棘比例高于持續(xù)暴露組(P0.01)。4.豐富環(huán)境對Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)的影響。通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),豐富環(huán)境改善了Pb、Cd、Hg混合暴露所致的突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷:具體表現(xiàn)在與對照組相比,持續(xù)暴露組和斷乳前暴露組大鼠海馬CA1區(qū)突觸密度降低、PSD厚度變薄、突觸間隙變寬和突觸活性帶長度變短(P0.01);而相比于斷乳后自然恢復的斷乳前暴露組,豐富環(huán)境的干預使大鼠海馬CA1區(qū)突觸密度和PSD厚度增加(P0.05),斷乳前暴露的大鼠和豐富環(huán)境干預的大鼠相比于持續(xù)暴露的大鼠突觸間隙變窄(P0.01),但是豐富環(huán)境的干預能使突觸活性帶長度改善,但尚不能恢復對照組水平(P0.05)。5.豐富環(huán)境對Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠海馬Snk、SPAR m RNA和蛋白表達影響。通過RT-PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),豐富環(huán)境降低了Pb、Cd、Hg混合暴露所致Snk的m RNA和蛋白表達的升高。持續(xù)暴露組大鼠海馬Snk m RNA和蛋白表達高于對照組(P0.05),而斷乳前暴露組和豐富環(huán)境干預組大鼠海馬Snk的m RNA和蛋白表達均低于持續(xù)暴露組(P0.05),豐富環(huán)境干預組大鼠海馬Snk的m RNA和蛋白表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);各處理組大鼠海馬SPAR的m RNA表達差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境上調(diào)了Pb、Cd、Hg混合暴露所致大鼠海馬SPAR表達水平的下降。與對照組相比,持續(xù)的Pb、Cd、Hg的混合暴露以及斷乳前Pb、Cd、Hg混合暴露導致大鼠海馬的SPAR的表達降低(P0.01),而相比于自然恢復的斷乳前暴露組,豐富環(huán)境的干預使海馬CA1區(qū)SPAR的表達增加(P0.05),但尚未增加到對照組水平(P0.05)。6.豐富環(huán)境對Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),豐富環(huán)境干預能改善Pb、Cd、Hg混合暴露所致海馬神經(jīng)元損傷。通過電鏡檢測發(fā)現(xiàn),持續(xù)暴露組和斷乳前暴露組大鼠海馬神經(jīng)元核內(nèi)染色質(zhì)聚集成團邊集,核膜尚完整,細胞器數(shù)目也出現(xiàn)減少,線粒體有較嚴重的腫脹,嵴斷裂而模糊不清,而豐富環(huán)境干預組大鼠與對照組則相似,其海馬神經(jīng)元核膜光滑,染色質(zhì)分布較均勻,細胞器數(shù)目增加,線粒體及其嵴形態(tài)也較完整清晰。通過流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,持續(xù)暴露組和斷乳前暴露組大鼠海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)活性氧水平和細胞凋亡水平均顯著增高(P0.01);與自然恢復的斷乳前暴露組大鼠相比,豐富環(huán)境干預組大鼠的海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)活性氧水平降低了16.75%、細胞凋亡水平降低了32.28%(P0.01)。研究結(jié)論:1.Pb、Cd和Hg的混合暴露能造成大鼠的認知損傷,而且生命早期此三種重金屬混合暴露,斷乳后脫離暴露至成年后,大鼠認知損傷很難自然恢復;2.豐富環(huán)境能改善Pb、Cd和Hg混合暴露所致大鼠的認知損傷,可能與大鼠突觸結(jié)構(gòu)可塑性和樹突棘支架蛋白SPAR表達有關(guān);也可能與豐富環(huán)境降低了海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平及神經(jīng)元損傷有關(guān)。3.豐富環(huán)境改善Pb、Cd和Hg混合暴露所致大鼠的認知損傷,為進一步深入研究重金屬污染物的神經(jīng)毒性損傷改善提供科學依據(jù)。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：X171.5;R99
【部分圖文】：

程度上已經(jīng)被證明可以顯著減少 Cd 所介導的基因大、成本高，效果也有待研究確定。近年來，豐富環(huán)EE）再生理論的提出為神經(jīng)性疾病的防治研究帶來環(huán)境是指相對于標準環(huán)境而言，在生存環(huán)境和社會的無生命物與社會刺激的復合環(huán)境，具體表現(xiàn)為較物理運動、社會性刺激及相互交往的機會等[29]。Jo對缺血性腦梗死大鼠腦功能的恢復時發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)腦梗死大鼠海馬樹突棘數(shù)量[30]。在對人類的觀察中其腦內(nèi)的一些區(qū)域能夠出現(xiàn)結(jié)構(gòu)以及功能上的生化也發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境的干預（如圖 1.1 所示）[32]。豐富原因?qū)е碌纳窠?jīng)退行性疾病的癥狀、提高動物的學緩解焦慮樣情緒等[32-34]，也有研究表明飼養(yǎng)于豐富腦皮層、海馬和小腦等解剖學上也出現(xiàn)了變化，其密度均發(fā)生了改變，這些形態(tài)學的變化與豐富環(huán)境關(guān)[35,36]。

第 2 章 材料與方法（6）視覺： PND12-PND21 進行，出生第 12d 開始，在仔鼠將要睜眼睛的時候?qū)⒆惺蟊┞对陂W爍的燈光下 15s，在視覺刺激期間撫摸仔鼠以使其保持活躍。在大鼠在斷乳之后（PND21-PND83），將大鼠轉(zhuǎn)入更大的環(huán)境豐富籠中進行社會刺激，每籠放入 11 只大鼠（對照組為一般標準環(huán)境，每籠 3 只大鼠）。環(huán)境豐富籠內(nèi)具有更大的空間，并且具有豐富的籠舍環(huán)境，如隧道、坡道、平臺、滾輪、秋千、積木和球等（如圖 2.1 所示），為了保證對實驗動物具有足夠的社會性刺激，籠內(nèi)玩具每周更新一次。

圖 3.1 豐富環(huán)境對 Pb、Cd 和 Hg 混合暴露大鼠生長體重的影響（Means±SD） 成年大鼠全血以及腦組織中 Pb、Cd 和 Hg 重金屬含量通過對大鼠全血以及腦組織的三種重金屬元素含量檢測發(fā)現(xiàn)，CE 組全 Pb、Cd 和 Hg 的含量都明顯高于 Control 組（P＜0.05）；斷乳后自然PE 組和豐富環(huán)境干預的 PEE 組全血以及腦中的 Cd 和 Hg 含量均低于 C
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本文編號：2850168