由硫氧還蛋白還原酶(TrxR)、硫氧還蛋白(Trx)和NADPH組成的硫氧還蛋白系統(tǒng)是維持生物體氧化還原平衡和基于氧化還原信號(hào)通路調(diào)節(jié)的關(guān)鍵抗氧化系統(tǒng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明硫氧還蛋白系統(tǒng)與人類許多疾病密切相關(guān)。哺乳動(dòng)物TrxR蛋白主要以細(xì)胞質(zhì)TrxR1和線粒體TrxR2兩種形式存在,它是含有硒代半胱氨酸(Sec)殘基的硒黃素酶。TrxRs催化電子從NADPH轉(zhuǎn)移到Trxs的活性位點(diǎn)進(jìn)而還原Trxs,而還原態(tài)Trxs與下游靶點(diǎn)的相互作用對(duì)多種基于氧化還原的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控,包括細(xì)胞增殖、分化和死亡。惡性腫瘤細(xì)胞的硫氧還蛋白水平通常高于正常細(xì)胞,靶向Trx/TrxR系統(tǒng)被認(rèn)為是阻止腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的有效方法。因此,近年來(lái)人們一直致力于開(kāi)發(fā)針對(duì)TrxR的小分子作為癌癥的潛在治療劑。虛擬篩選是應(yīng)用計(jì)算機(jī)方法從化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇目標(biāo)化合物的策略,其被廣泛應(yīng)用于從百萬(wàn)數(shù)量級(jí)的類藥分子數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選出潛在的活性候選化合物,相比較于傳統(tǒng)的篩選流程可以顯著降低研發(fā)成本和時(shí)間。而基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選(Structure-Based Virtual Screening,SBVS)適用于受體結(jié)構(gòu)已知的情況,首先化合物與前期選擇的目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接,通過(guò)對(duì)結(jié)合模式進(jìn)行預(yù)測(cè),SBVS將對(duì)接分子進(jìn)行排序,排序?qū)⒆鳛檫x擇潛在分子的標(biāo)準(zhǔn),或者與其他評(píng)價(jià)方法綜合使用,然后對(duì)所選擇的化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià),進(jìn)而確定它們對(duì)分子靶標(biāo)的生物活性。本論文運(yùn)用SBVS策略成功地從天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)十萬(wàn)個(gè)分子中發(fā)現(xiàn)了新的TrxR抑制劑,該研究充分證明了虛擬篩選策略的高效性和選擇性。我們對(duì)打分靠前的15個(gè)化合物進(jìn)行了毒活和酶抑制活性測(cè)試,測(cè)試結(jié)果顯示化合物6、7、11和12表現(xiàn)出選擇性的腫瘤細(xì)胞毒活性。而細(xì)胞外純TrxR及細(xì)胞內(nèi)TrxR活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)15種化合物不同程度的對(duì)TrxR的活性產(chǎn)生了抑制,特別需要指出的是化合物2、3、6、7、11和12對(duì)TrxR表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。鑒于目標(biāo)化合物具有結(jié)構(gòu)相似性,我們對(duì)化合物2、7和12利用共價(jià)分子對(duì)接對(duì)其結(jié)合模式進(jìn)行分析。結(jié)合模式分析表明,抑制劑與TrxR活性位點(diǎn)之間的多種非共價(jià)相互作用促進(jìn)了TrxR上的Sec498與抑制劑上的α,β-不飽和酮之間的共價(jià)鍵的形成,以及與TrxR上的Lys29、R351發(fā)生一系列非共價(jià)相互作用進(jìn)而阻礙了TrxR和Trx之間的相互作用。機(jī)理分析表明,化合物7通過(guò)抑制TrxR導(dǎo)致氧化態(tài)Trx的積累和ROS水平的升高,并進(jìn)一步促進(jìn)HeLa細(xì)胞中氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡�？傊�,將虛擬篩選運(yùn)用到開(kāi)發(fā)TrxR抑制劑這一策略可以有助于加速?gòu)男》肿訑?shù)據(jù)庫(kù)中篩選出可以作為潛在治療劑的TrxR抑制劑�；谔摂M篩選的研究策略和篩選化合物結(jié)合模式的共價(jià)分子對(duì)接,我們后期選出類似結(jié)構(gòu)的三種天然產(chǎn)物小分子蒼耳亭、鵝掌楸內(nèi)酯和小豆蔻明進(jìn)行以硫氧還蛋白還原酶為靶點(diǎn)抗癌機(jī)制研究。其中,蒼耳亭和鵝掌楸內(nèi)酯分別是從中傳統(tǒng)草藥蒼耳子和鵝掌楸中分離出來(lái)的天然倍半萜內(nèi)酯,而小豆蔻明側(cè)是從姜科植物草豆蔻的干燥成熟種子中分離出來(lái)的查爾酮,三種化合物均已被證明具有潛在的抗癌活性。在本論文中對(duì)它們的抗癌機(jī)制展開(kāi)了研究,首先我們證明蒼耳亭、鵝掌楸內(nèi)酯和小豆蔻明均可以有效抑制胞外TrxR以及細(xì)胞內(nèi)TrxR的活性,并且TrxR酶C末端的Sec殘基是主要的抑制目標(biāo)。隨后,生物活性實(shí)驗(yàn)顯示三種天然產(chǎn)物小分子均可以引起細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡�？傊�,我們的結(jié)果首次解釋了三種天然產(chǎn)物小分子化合物以TrxR為靶點(diǎn)的抗癌作用機(jī)制,并為開(kāi)發(fā)潛在的靶向TrxR抑制劑的抗癌藥物提供了理論支撐。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R914;R96
【部分圖文】：

GSH和Trx系統(tǒng)

圖 1-2 硫氧還蛋白系統(tǒng)的底物和主要功能[27]Figure 1-2 The substrates and functions of thioredoxin system. Solid lines indicate thiol-disulfideexchange reactions, and doted lines show direct binding. Oxidative stress promotes Nrf2activation to induce Trx and TrxR expression.Trx1 主要位于胞質(zhì)溶膠中，它為 RNR 提供電子并催化還原 Prxs[2]和Msrs[28]。在氧化條件下 Trx1 可以轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，并通過(guò)調(diào)節(jié) NF B、HIF、p53、Nrf2、AP-1 和糖皮質(zhì)激素受體等轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[29-31]。此外，還原態(tài) Trx1 可以直接結(jié)合 PTEN，PTEN 是一種通過(guò) PI3K/Akt 通路失活來(lái)阻止存活信號(hào)的腫瘤抑制因子。與 Trx1 結(jié)合抑制了 PTEN 的磷酸酶活性并促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)也抑制細(xì)胞凋亡[32]。Trx 也是凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 ASK1 的重要調(diào)節(jié)因子，還原態(tài) Trx 可以結(jié)合并抑制 ASK1。然而，高水平的 ROS 會(huì)促進(jìn) Trx 的氧化，因此釋放 ASK1 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[33]。Trx 與 TXNIP（人硫氧還蛋白相互作用蛋白）相互作用蛋白也可以促進(jìn) ASK1 釋放，TXNIP 是 Trx 的內(nèi)源性抑制劑，其與還原態(tài) Trx 結(jié)合并同 ASK1

硫氧還蛋白還原酶分類和催化活性rxRs 是一種二聚體黃素酶，它和谷胱甘肽還原酶同屬于吡啶核苷酸二硫還原酶家族[10, 37]。它們有兩種存在形式，低分子 TrxRs（大約 35kDa）等真核生物和原核生物中，高分子 TrxRs（約 55kDa）存在于高等真核8, 39]。低分子 TrxRs 含有一個(gè) FAD 和一個(gè)氧化還原活性二硫鍵序列，但于大 TrxR 變體的 C 末端 XCU/CX 活性位點(diǎn)[38, 40]。大多數(shù)高分子 Trx乳動(dòng)物TrxRs）含有XCUX序列的硒代半胱氨酸，含有XCCX序列的Trx現(xiàn)在某些寄生蟲(chóng)和昆蟲(chóng)中。乳動(dòng)物 TrxR 的主要催化機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究，其通過(guò)酶結(jié)合的 FAD 將NADPH 轉(zhuǎn)移至氧化的 N 末端二硫鍵序列，還原的二硫醇將這些電子與基的 C 末端活性位點(diǎn)中的谷胱甘肽硒基硫醚進(jìn)行交換，形成還原的硒，從而有助于 Trx 和 DNTB 等大多數(shù)底物的還原[41, 42]（圖 1-3A）。包含多種底物并不需要完整的 Sec 殘基，它們可以通過(guò) N 末端的 C59/C64 列直接進(jìn)行還原[43]。
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