研究目的:(1)評價新型氨基酸卟啉光敏劑4I對臨床分離的11種敏感菌株和多重耐藥菌株的抗菌活性,并比較4I介導的a PDT對臨床分離的同一菌種的多重耐藥菌和敏感菌之間的差異;(2)檢測4I對Hacat(永生化表皮細胞)及RAW264.7(單核-巨噬細胞)的細胞毒性,為進一步的體內實驗提供基礎。研究方法:(1)抗菌活性實驗依據臨床藥敏結果選取所需菌株,挑取新鮮菌落制備菌懸液,設置a PDT組(4I+菌液+光照)、避光組(4I+菌液+未光照)、陰性對照組(菌液+純水+光照)、空白對照組(培養(yǎng)基+純水+光照)共4組,設8個濃度梯度,最高濃度為62.5μM,最低濃度為0.49μM。二倍稀釋法將不同濃度光敏劑與菌懸液避光孵育30min后,除避光組外,其余立即行紅色激光照射30min(650nm,6J/cm2),采用涂板計數法評定出4I對不同菌株的MIC和MBC值,計算ED50和ED90濃度;并比較4I對臨床分離的同一菌種的多重耐藥菌和敏感菌之間的差異;(2)細胞毒性實驗培養(yǎng)收集Hacat、RAW264.7,96孔板內接種,實驗分為aPDT組(4I+培養(yǎng)基+細胞+光照),避光組(4I+培養(yǎng)基+細胞+未光照)共2組,每組分別設置對照組(培養(yǎng)基+細胞+光照/未光照)、空白組(培養(yǎng)基+CCK8)以及7個不同濃度梯度的藥物組,最高濃度為62.5μM,最低濃度為0.98μM,貼壁培養(yǎng)24h后,棄掉上清液,加入二倍稀釋法稀釋好的藥液或新培養(yǎng)基,避光孵育30min,孵育后,a PDT組立即照射30min(參數同抗菌活性實驗),避光組同等條件下不接受光照避光靜置30min,更換含有CCK-8的培養(yǎng)基100ul/孔(10ul CCK-8:100ul培養(yǎng)基),酶標儀450nm處測量吸光度,記錄結果。結果:(1)抗菌活性實驗新型氨基酸卟啉光敏劑4I對臨床篩選出的11種菌種,除奇異變形桿菌、摩根摩根菌外,其余菌株全部有效,抑菌效果與藥物濃度成正比,對革蘭氏陽性菌的殺菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌(P0.01),對于同一菌種的敏感菌和多重耐藥菌抑菌效果未見明顯差異(P0.05),抑制50%菌種的全部菌株生長的有效抑菌濃度值(ED50)和抑制90%菌種的全部菌株生長的有效抑菌濃度值(ED90)的相應藥物濃度分別為0.822μM(95%CI 0.590-1.065μM)和1.947μM(95%CI 1.434-3.612μM);單純4I避光組,對細菌生長無抑制作用;單純紅色弱激光650nm,能量密度6J/cm2作用下,對細菌生長無抑制作用。(2)細胞毒性實驗單純給予紅色激光照射,對Hacat有促進細胞生長作用(P0.001);對RAW264.7生長沒有影響(P0.999)。單純給予光敏劑藥物孵育30min,對Hacat有促進生長的作用(P0.05),不同濃度組別之間的促生長作用無明顯差異(P0.05);較高濃度組62.5μM至15.6μM對RAW264.7有輕度抑制作用(P0.001),其余濃度組對生長無影響(P0.05)。a PDT后,兩種細胞的存活率都明顯降低,不同濃度組殺傷作用之間未見明顯差異(P0.05),4I介導的a PDT后Hacat和RAW264.7的細胞毒性IC50濃度值為分別為1.846μM(95%CI0±6.416μM)和7.447μM(95%CI 1.110±20.087μM)。結論:(1)新型氨基酸卟啉類光敏劑4I具有高效、廣譜的抗菌活性,無細胞毒性,低毒副作用,是一種前景極佳的抗菌光敏劑。(2)4I具有促進細胞生長的作用,因此4I結合紅色弱激光的光動力抗菌療法具有廣闊的臨床應用前景。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

法科學院生物工程研究所研制，針對前期實驗以改進，以取代的四苯基卟啉為基礎，引入性氨基酸卟啉光敏劑：5，10，15，20-四{4-}卟啉，編碼縮寫為 4I（結構見圖 1），通過前期的光熱穩(wěn)定性、親水性，高細菌吞噬量，高。通過擴大細菌種類，評價光敏劑 4I 對臨床直菌活性，并比較 4I 對同一菌種的敏感菌株和異，同時檢測 4I 光敏劑對人永生化表皮細胞264.7）的細胞毒性，為進一步體內實驗提供

圖 2.4I 抗菌活性實驗 96 孔板排板圖 2 注：A.aPDT 組（4I+菌液+光照）B.避光組(4I+菌液+未光照)C.陰性對照組（菌液+純水+光照/未光照）D.空白對照組（培養(yǎng)基+純水+光照）1.1.7 實驗步驟①除 62.5μM 濃度組外，每孔加入純水 100μl。②向 62.5μM 濃度組加入 125μM 藥液 200μl/孔，取 100μl/孔加入到下一個

圖 3. aPDT 組表皮葡萄球菌 a.4I 光敏劑 15.6～3.9μM 濃度組 b. 4I 光敏劑 1.95～0.975μM 濃度組 c. 4I 光敏劑 0.49μM 濃度組 d.未加 4I 光敏劑的陰性對照組1.2.2 光敏劑 4I 對同一菌種的敏感菌和耐藥菌藥敏結果比較（表 3）表 3.同一菌種的敏感菌和耐藥菌藥敏結果比較菌 最小抑菌濃度 最小殺菌濃度株 RSRRMann-Whitney U 值 Z P（雙側）RSRRMann-Whitney U 值 Z P（雙側）革蘭氏陽性菌 G+

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