目的病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是由柯薩奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)感染引發(fā)的機(jī)體免疫反應(yīng),主要發(fā)病于青少年和兒童,常表現(xiàn)為心肌細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤,進(jìn)一步發(fā)展為慢性心肌病、擴(kuò)張型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)和充血性心衰,嚴(yán)重的可導(dǎo)致急性心力衰竭甚至引發(fā)猝死。然而,目前VMC的發(fā)病機(jī)理仍不清晰,尚且缺乏高效精準(zhǔn)的治療方法及安全有效的治療藥物,因此,探索病毒性心肌炎癥的發(fā)病機(jī)制,為臨床尋找安全、有效的治療藥物極其重要。FNC是一種新型的核苷類似物,前期的研究表明其具有非常明顯的抗艾滋病毒(HIV)以及抗乙型肝炎病毒(HBV)功效,但關(guān)于其抗柯薩奇病毒B3的研究未見報(bào)道。因此,本課題通過建立病毒性心肌炎體外細(xì)胞模型以及體內(nèi)動物模型,探索FNC的抗CVB3活性以及對心肌損傷、炎性浸潤的治療作用,為尋找高效低毒的抗病毒藥物提供理論依據(jù)。方法1體外研究1.1藥效實(shí)驗(yàn)采用終點(diǎn)稀釋法測定本實(shí)驗(yàn)所用CVB3的滴度TCID_(50),選取合適的病毒感染量;通過CVB3感染生長狀態(tài)良好的Hela細(xì)胞,建立VMC細(xì)胞模型;采用MTT法及三種不同的給藥方法,檢測FNC體外抗CVB3活性及作用方式。1.2機(jī)制研究根據(jù)FNC的有效劑量,通過RT-PCR法,檢測FNC體外對病毒、免疫應(yīng)答及炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響;通過Western Blot法檢測FNC對NF-κB蛋白表達(dá)的影響。2體內(nèi)研究2.1藥效實(shí)驗(yàn)通過雄性Balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒稀釋液,建立VMC動物模型,連續(xù)灌胃給藥一周,觀察小鼠狀態(tài)、記錄體重變化;摘眼球取血,采用ELISA法測定各組小鼠血清中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)以及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性的變化;進(jìn)行小鼠心肌組織病理學(xué)檢查,評價(jià)FNC對VMC小鼠心肌的保護(hù)作用。2.2機(jī)制研究通過RT-PCR法檢測FNC對病毒基因在小鼠心臟、胰腺以及肝臟中表達(dá)水平的影響;采用ELISA法檢測FNC對血清中炎癥因子IL-4,IL-6和TNF-α分泌的影響。結(jié)果1體外研究1.1藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果CVB3滴度TCID_(50)為10~(-7.8)。FNC對Hela細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC_(50)為858.517±44.099μg/ml,對CVB3病毒的半數(shù)抑制濃度IC_(50)為1.834±1.711 ng/ml,治療指數(shù)TI為4.681×10~5;陽性對照藥物利巴韋林的TC_(50)值為209.117±46.042μg/m,IC_(50)為7.343±3.028μg/ml,TI為28.478。結(jié)果表明,FNC可以通過預(yù)防、治療以及直接作用病毒三種方式發(fā)揮很好的抗CVB3活性,其中治療法效果最好。1.2機(jī)制研究結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示,基因水平上,FNC對CVB3病毒衣殼基因VP-1的表達(dá)具有明顯抑制作用,同時(shí)下調(diào)固有免疫反應(yīng)相關(guān)基因TLR3、TLR7、RIG-1、MDA-5、NF-κB以及炎癥相關(guān)基因IL-4、IL-6、TNF-α的表達(dá)(P0.05);Western Blot實(shí)驗(yàn)表明,在蛋白水平上,病毒感染后細(xì)胞中的NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào),而FNC能夠有效抑制其表達(dá),發(fā)揮抗炎癥作用(P0.05)。2體內(nèi)研究2.1藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果成功構(gòu)建VMC小鼠模型,結(jié)果顯示,FNC可有效緩解病毒性心肌炎癥狀,降低血清心肌酶活性。另外,病理組織切片結(jié)果也直觀表明FNC可抑制心肌壞死及炎性浸潤,對病毒性心肌炎有很好的治療作用。2.2機(jī)制研究結(jié)果FNC不僅有效抑制心肌炎小鼠心臟、胰腺、肝臟中的CVB3病毒的復(fù)制,而且能抑制血清中炎癥因子IL-4,IL-6和TNF-α的表達(dá),同時(shí)發(fā)揮抗病毒、抗炎癥的作用(P0.05)。結(jié)論1.FNC在體內(nèi)、體外皆具有顯著的抗CVB3活性。2.FNC發(fā)揮抗CVB3活性的機(jī)制可能與抑制病毒復(fù)制及炎癥反應(yīng)有關(guān)。3.FNC抑制病毒復(fù)制的方式主要為進(jìn)入細(xì)胞,抑制病毒的生物合成。4.FNC可能通過下調(diào)固有免疫識別受體的表達(dá),抑制NF-κB信號通路,減少炎癥因子分泌,降低炎癥損傷。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【文章目錄】：
摘要
abstract
引言
第一部分 FNC體外抗柯薩奇病毒B3活性及機(jī)制研究
    1 材料與儀器
        1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        1.2 實(shí)驗(yàn)病毒
        1.3 實(shí)驗(yàn)藥物
        1.4 主要試劑
        1.5 主要儀器
        1.6 溶液配置
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 FNC體外抗CVB3藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)
            2.1.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存
            2.1.2 FNC對Hela細(xì)胞的毒性測定
            2.1.3 CVB3病毒擴(kuò)增
            2.1.4 CVB3滴度測定
            2.1.5 FNC體外抗CVB3活性實(shí)驗(yàn)
            2.1.6 三種作用方式檢測FNC體外抗CVB3活性
        2.2 FNC體外抗CVB3機(jī)制的初步探索
            2.2.1 FNC體外抗CVB3對病毒、免疫及炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響
                2.2.1.1 引物設(shè)計(jì)與合成
                2.2.1.2 細(xì)胞中總RNA的提取
                2.2.1.3 RNA提取質(zhì)量檢測
                    2.2.1.3.1 RNA純度檢測
                    2.2.1.3.2 RNA完整性檢測
                2.2.1.4 RNA反轉(zhuǎn)錄
                2.2.1.5 RT-PCR反應(yīng)
            2.2.2 FNC對CVB3感染的Hela細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)的影響
                2.2.2.1 細(xì)胞總蛋白的提取
                2.2.2.2 BCA法測定蛋白濃度
                2.2.2.3 制備聚丙烯酰胺凝膠
                2.2.2.4 上樣及電泳
                2.2.2.5 轉(zhuǎn)膜
                2.2.2.6 封閉
                2.2.2.7 孵育一抗
                2.2.2.8 孵育二抗
                2.2.2.9 成像
    3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 FNC體外抗CVB3藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            4.1.1 FNC對Hela細(xì)胞毒性結(jié)果
            4.1.2 CVB3的病毒滴度結(jié)果
            4.1.3 FNC體外抗CVB3活性結(jié)果
            4.1.4 FNC體外對CVB3的作用方式
        4.2 FNC體外抗CVB3機(jī)制研究結(jié)果
            4.2.1 RNA質(zhì)量檢測結(jié)果
            4.2.2 FNC體外抗CVB3對病毒、免疫及炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響結(jié)果
            4.2.3 FNC對CVB3感染的Hela細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)的影響結(jié)果
    5 討論
    6 小結(jié)
第二部分 FNC體內(nèi)抗柯薩奇病毒B3活性及機(jī)制研究
    1 材料與儀器
        1.1 實(shí)驗(yàn)病毒
        1.2 實(shí)驗(yàn)動物
        1.3 實(shí)驗(yàn)藥物
        1.4 主要試劑
        1.5 主要儀器
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 FNC體內(nèi)抗CVB3藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)
            2.1.1 建立病VMC小鼠模型
            2.1.2 動物處理
            2.1.3 血清酶活檢測
            2.1.4 心臟病理組織檢測
        2.2 FNC體內(nèi)抗CVB3機(jī)制的研究
            2.2.1 RT-PCR法檢測小鼠臟器中CVB3基因的表達(dá)
                2.2.1.1 引物設(shè)計(jì)與合成
                2.2.1.2 組織中總RNA的提取
                2.2.1.3 反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR反應(yīng)
            2.2.2 血清炎癥因子的檢測
    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 FNC體內(nèi)抗CVB3的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            4.1.1 接種CVB3病毒對Balb/c小鼠狀態(tài)的影響
            4.1.2 FNC對VMC小鼠血清酶活影響
            4.1.3 心臟病理學(xué)檢測結(jié)果
        4.2 FNC體內(nèi)抗CVB3機(jī)制研究結(jié)果
            4.2.1 FNC對VMC小鼠臟器中CVB3基因的影響結(jié)果
            4.2.2 FNC對VMC小鼠血清中炎癥因子的影響
    5 討論
    6 小結(jié)
全文結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)
展望
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡介
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2831755