脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜上的主要成分,不但能夠阻礙抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部發(fā)揮抗菌作用,而且還是引發(fā)炎癥反應(yīng)的主要誘因。失控的局部炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致全身性炎癥或膿毒癥等疾病,對(duì)組織和器官引起不同程度的損傷,嚴(yán)重的甚至?xí)䦟?dǎo)致生物體死亡。目前還沒有開發(fā)出能夠有效中和LPS的成熟藥物�？咕膩碓磸V泛,作為生物體先天免疫系統(tǒng)的重要成員,具有廣譜抗菌活性且不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),某些抗菌肽還具有中和LPS及調(diào)節(jié)免疫功能,是研發(fā)拮抗LPS抗炎藥物的理想候選。Chensinin-1是本實(shí)驗(yàn)室從中國林蛙(Ranachensinensis)皮膚分泌物中分離純化得到的一種含有18個(gè)氨基酸的短肽,該抗菌肽具有分子量小,陽離子性強(qiáng)等特征,對(duì)革蘭氏陽性菌有較好的抗菌活性。前期研究中對(duì)chensinin-1進(jìn)行改造,以疏水性較強(qiáng)的色氨酸替換了疏水性較弱的甘氨酸,并調(diào)整氨基酸序列增強(qiáng)了其兩親性得到了它的改造肽chensinin-1b,其抗菌活性尤其是對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌能力與模板肽相比有顯著的提高。本文首先研究了 chensinin-1b對(duì)革蘭氏陰性菌選擇性殺菌活性的分子機(jī)制。NPN檢測(cè)chensinin-1b對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的滲透性,結(jié)果表明chensinin-1b對(duì)大腸桿菌外膜有較強(qiáng)的滲透能力,chensinin-1相對(duì)較弱。制備去除細(xì)胞壁外膜的大腸桿菌原生質(zhì)體,兩種抗菌肽對(duì)原生質(zhì)體的去極化作用和抗菌活性與大腸桿菌相比均有不同程度提高,而對(duì)LPS環(huán)境中的原生質(zhì)體的去極化及抗菌能力又有所下降,其中chensinin-1下降的程度較chensinin-1b 更大,說明 chensinin-1 無法像 chensinin-1b 一樣作用于 LPS,提示chensinin-1和chensinin-1b對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌抗菌活性的不同,是由于二者對(duì)革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜中LPS作用程度不同引起的。等溫滴定量熱(isothermaltitrationcalorimetry,ITC)實(shí)驗(yàn)和Zeta電勢(shì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定chensinin-lb與LPS之間的相互作用。ITC顯示,chensinin-1b與LPS的結(jié)合是一個(gè)先放熱后吸熱的過程,先后由焓和熵驅(qū)動(dòng)。表明chensinin-1b先以靜電作用和LPS吸附結(jié)合,再以疏水作用插入到LPS中。通過分析熱力學(xué)參數(shù),得出結(jié)論chensinin-1b的結(jié)合系數(shù)較大,說明與LPS有較強(qiáng)的結(jié)合能力,而chensinin-1較弱。Zeta電勢(shì)實(shí)驗(yàn)從電荷補(bǔ)償?shù)姆矫嬉灿∽C了同樣的結(jié)果。動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)和FITC-LPS解聚實(shí)驗(yàn)顯示chensinin-1b與LPS結(jié)合后,能不同程度解聚LPS聚集體,使聚合態(tài)的LPS分子粒徑由大變小,有利于chensinin-1b的插入。chensinin-1b對(duì)LPS的結(jié)合和解聚作用是chensinin-1b貫穿LPS的前提,熒光光譜顯示chensinin-1b的自發(fā)熒光吸收峰隨著LPS濃度的升高發(fā)生了藍(lán)移,并伴隨著熒光強(qiáng)度的升高。淬滅劑的加入并不能完全淬滅熒光,說明chensinin-1b插入到LPS疏水內(nèi)部使淬滅劑無法接觸進(jìn)而產(chǎn)生淬滅作用。原位紅外光譜檢測(cè)LPS內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),隨著chensinin-1b作用時(shí)間的而增加,LPS內(nèi)部的磷酸基團(tuán)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,說明chensinin-1b能夠通過疏水作用貫穿LPS并導(dǎo)致LPS的解離。鱟試劑顯色實(shí)驗(yàn)(Limulus amebocyte lysate test,LAL)顯示 chensinin-1b 可以很好的中和 LPS。LPS是炎癥反應(yīng)信號(hào)通路的觸發(fā)劑,本文進(jìn)一步研究了 chensinin-1b對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型的影響。結(jié)果顯示chensinin-1b能夠抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子和介質(zhì)如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)、一氧化氮(NO)的釋放。chensinin-1b對(duì)炎癥的抑制能力要強(qiáng)于chensinin-1。在對(duì)RAW264.7作用中,利用激光共聚焦顯微鏡觀察到抗菌肽chensinin-1b能夠在短時(shí)間內(nèi)就進(jìn)入到RAW264.7細(xì)胞內(nèi)部,這意味著chensinin-1b可以在細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮抗炎作用。我們使用chensinin-1b預(yù)處理方法考察chensinin-1b在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)部的抗炎作用,結(jié)果顯示chensinin-1b的預(yù)處理能夠降低炎癥因子TNF-α、IL-6的含量,對(duì)炎癥因子的抑制率約占正常處理組的80%以上,也就是說chensinin-1b在細(xì)胞外部中和LPS并非是它抑制炎癥的主要途徑,在細(xì)胞內(nèi)部的作用才是chensinin-1b的主要抗炎機(jī)制。Western Blot檢測(cè)了 chensinin-1b對(duì)胞漿蛋白NOD1和NOD2表達(dá)的影響,結(jié)果顯示chensinin-1b可以抑制LPS誘導(dǎo)的NOD1和NOD2的過表達(dá)。NOD1和NOD2可激活下游的核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路,使用RT-qPCR,檢測(cè)到抗菌肽chensinin-1b抑制了 NOD1/NOD2介導(dǎo)通路蛋白NF-κB的mRNA表達(dá),Western Blot結(jié)果表明chensinin-1b對(duì)MAPK信號(hào)通路中的主要通路蛋白ERK/JNK/p38的磷酸化水平也有顯著的抑制作用。利用細(xì)胞膜去極化實(shí)驗(yàn)研究了 chensinin-1b的內(nèi)化途徑,結(jié)果表明chensinin-1b并不能引起RAW264.7細(xì)胞膜電位的變化,說明chensinin-1b是以非破膜的方式進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。通過研究低溫和多種內(nèi)吞抑制劑處理對(duì)chensinin-1b內(nèi)化的影響,發(fā)現(xiàn)chensinin-1b是以能量依賴的形式,并通過Na+/H+離子通道介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑為主進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部,發(fā)揮抗炎作用。綜上所述,抗菌肽chensinin-1b有效抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子和介質(zhì)的釋放,對(duì)LPS有較強(qiáng)的中和拮抗作用。但chensinin-1b中和LPS只在其抗炎活性中起一部分作用,更主要的抗炎機(jī)制是以能量依賴的Na+/H+離子通道介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑為主進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部,通過在細(xì)胞內(nèi)部作用于胞漿蛋白NOD1/NOD2,并降低其介導(dǎo)的NF-κB和磷酸化的ERK/JNK/p38 的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R915
【部分圖文】：

介導(dǎo)ＮＦ－ｋＢ通路，控制炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Ｐ７Ｉ。除了激活ＮＦ－ｋＢ途徑外，研究表逡逑明Ｎ０Ｄ１與Ｎ０Ｄ２受刺激后會(huì)招募下游的ＴＡＫ１，引起ＭＡＰＫ如ｐ３８、Ｅ民Ｋ和ＪＮＫ的逡逑活化產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。ＬＰＳ誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路圖如圖１．２。逡逑Ｗ邐灥逡逑Ｖ邋ｙ邋Ｉ邋ｆ邐心？二邋７＼邋＼邐＼＼逡逑化公＼邐＼ｍＡＰＫ逡逑戶ＭＳＲ氣。Ｋ吟護(hù)ｍ柳逡逑Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ邋ａｎｄ邋ｅｆｆｅｃｔｏｒ邋ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ逡逑圖１．２邋ＬＰＳ誘導(dǎo)的炎癥通路示惠圖巧Ｉ自Ｊ．邋Ｃｏｈｅｎ，機(jī)Ｎａｔｕｒｅ．邋２００２，４２０（６９１７）：郎５－９１）逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ａ邋ｃａｒｔｏｏｎ邋ｏｕｔｌｉｎｉｎｇ邋化ｅ邋ｐａ化ｗａｙｓ邋ｏｆ邋ＬＰＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｍｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｉｎ邋化ｅ邋ｈｕｍａｎ邋ｂｏｄｙ（ｆｒｏｍ邋Ｊ．逡逑Ｃｏｈｅｎ．邋［Ｊ］．邋Ｎａｔｕｒｅ，邋２００２．４２０（６９１７）：８８５－９１），逡逑－７－逡逑

圖２．１邋ｃｈｅｎｓｉｎｉｎ－１和ｃｈｅｎｓｉｎｉｎ－化對(duì)大腸桿菌細(xì)胞外膜的n蟯改芰Γǎ停澹幔睿簀

本文編號(hào)：2828994