【摘要】：傳統(tǒng)的抗生素療法的發(fā)現(xiàn)及普及使得細菌感染性疾病的治療得到改善,但是由于長期以來的抗生素療法的濫用,造成細菌耐藥情況嚴重,耐藥菌分離率不斷攀升,細菌感性疾病死亡率不斷提高,世界衛(wèi)生組織在2015年開始發(fā)起“世界提高抗生素認識周”,而2018年的主題是“很快就沒有可用的抗生素了,我們急需做出改變”。因此抗生素耐藥問題不容小覷,亟待發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)新機制的細菌感染性疾病的治療方法。細菌耐藥的主要原因之一是生物背膜(BF)的形成,生物背膜使得細菌對抗生素的敏感度降低10-1000倍,而生物背膜的形成受到群體效應(yīng)的調(diào)控,群體效應(yīng)(QS)是一種調(diào)節(jié)細菌生物膜形成、毒力因子釋放等生物行為的機制,因此群體感應(yīng)抑制劑可以提高細菌對抗生素的敏感度,且使細菌處于無毒或低致病性狀態(tài)。其優(yōu)勢在于不影響蛋白質(zhì)的合成和細菌的生長,這樣既減少了細菌的可遺傳突變,也有利于聯(lián)用其他抗生素。并且也不會因為破壞細胞,造成毒素釋放,再度感染。群體效應(yīng)根據(jù)信號分子的種類大致分為四種:革蘭氏陽性菌中由寡肽類(AIP)介導(dǎo)的群體效應(yīng);革蘭氏陰性菌中由高絲氨酸內(nèi)酯類信號分子(AI-1)介導(dǎo)的群體效應(yīng);AI-2介導(dǎo)的群體效應(yīng);AI-3介導(dǎo)的群體效應(yīng)。其中AI-2及AI-3介導(dǎo)的群體效應(yīng)研究較少,由于AI-2廣泛的存在于革蘭氏陽性菌和陰性菌中,共計約有70個菌種,且AI-3的結(jié)構(gòu)機制目前尚不明確。因此本研究是集中于AI-2型群體效應(yīng)抑制劑(QSI)的研究。近年來,虛擬篩選在先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中起到了非常重要的作用,通過模擬小分子與受體之間的相互作用,預(yù)測化合物靶向性。分子對接方法分為剛性對接、半柔性對接和柔性對接,這三種對接方法的精確度依次升高,同時也因為計算量依次增大,導(dǎo)致篩選速度依次降低。前期初篩在計算機中完成,大大提高了藥物篩選的速度。GOLD是一個計算大分子與小分子結(jié)合模式的分子對接程序,是Sheffield大學(xué),GlaxoSmithKline公司和CCDC協(xié)作的產(chǎn)物。它采用遺傳算法(GA)進行蛋白-配體對接,對接時配體完全柔性和蛋白部分柔性,既做到受體活性位點氨基酸殘基和配體是柔性的,又使得計算量較全柔性對接降低很多,所以在保證了計算精確度的情況下,篩選速度也有所提升,為本研究提供諸多便捷。2002年Chen X等人報道了LuxP晶體結(jié)構(gòu),其中包含原有的AI-2信號分子,提供了受體結(jié)構(gòu)以及活性位點的位置,為基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選尋找小分子抑制劑提供了支撐。因此本課題采用GOLD基于LuxP晶體結(jié)構(gòu)開展AI-2型群體效應(yīng)抑制劑的虛擬篩選與化合物的設(shè)計。首先采用GOLD中wizard模塊虛擬篩選得到10個潛在抑制劑,再利用哈氏弧菌的生物發(fā)光實驗測得化合物的IC_(50)。生物活性篩選的菌株是選用哈氏弧菌BB170菌株,由于野生型哈氏弧菌中同時含有AI-1、AI-2兩種信號分子及其受體,而BB170菌株是哈氏弧菌的突變株,它缺少AI-1的受體LuxN,所以它不響應(yīng)AI-1的信號變化,這樣就不會干擾AI-2型群體效應(yīng)的測定�；钚詼y定以哈氏弧菌的生物發(fā)光強度為標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)其生物發(fā)光強度降低一半時,計此時化合物的濃度為測試化合物的IC_(50)。根據(jù)活性數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)特點確定以Str5015為先導(dǎo)化合物,并利用PyMOL和LigPlot+分析設(shè)計得到目標(biāo)化合物的母核,以及20個目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu),合成得到20個目標(biāo)化合物后,再次進行生物活性評價,得到活性與陽性對照相當(dāng)?shù)幕衔颵B-1,其IC_(50)達到7.1±2.89μM。綜上所述,本研究首先利用計算機虛擬篩選進行化合物篩選,再經(jīng)哈氏弧菌體外活性測試找到IC_(50)達到60μM的先導(dǎo)化合物3-溴苯基-3,5-二溴-2-羥基苯甲酸酯(Str5015),結(jié)合Str5015在活性位點與受體結(jié)合產(chǎn)生的相互作用,經(jīng)合理設(shè)計分析后改造并合成了20個化合物,所有化合物均經(jīng)過~1H-NMR和MS的確證。經(jīng)活性測試發(fā)現(xiàn)了幾乎所有目標(biāo)化合物都有一定活性,且其中有活性達到7.1±2.89μM的結(jié)構(gòu)新穎的化合物3,5-二溴-N-(2-溴-4-硝基苯基)-4-羥基苯甲酰胺(YB-1),此活性結(jié)果與陽性對照相當(dāng),并根據(jù)所有目標(biāo)化合物活性結(jié)果總結(jié)構(gòu)效關(guān)系:(1)兩個苯環(huán)之間用酰胺鍵連接的活性優(yōu)于用酯鍵連接;(2)R_4位置引入硝基可顯著提高活性,且該位置取代基的吸電子能力越強,化合物活性越好;(3)當(dāng)R_4位置為較強吸電子基團且R_3位置為較強給電子基團時,化合物活性較好;(4)當(dāng)R_6為溴取代且R_5位置無取代時活性較好;(5)R_7位被碳酸酯鏈取代后活性將會得到提升。本研究對進一步改造YB-1尋找活性更好的小分子抑制劑有指導(dǎo)幫助的作用。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R914;R96
【圖文】：

軍事科學(xué)院碩士學(xué)位論文續(xù)表 1- 1 幾種常見的革蘭氏陰性菌中的 AHL 的結(jié)構(gòu)表Signal molecule Function organSLOOHNO Oconjugaltransfer of pTiAgrobactumefa(TraI/THSOOHNO OVirulence factorPseudoaerug(LasI/L Vibrio fischeri 中自誘導(dǎo)劑為 OHHL，它是由 LuxI 合成，能夠自細菌密度增加時，OHHL 的濃度也會隨之提高，當(dāng) OHHL 的濃，它與受體 LuxR 結(jié)合形成復(fù)合物，當(dāng)密度較低時，LuxR 不能與其自身的不穩(wěn)定性，會快速降解。OHHL-LuxR 復(fù)合物會啟動控的轉(zhuǎn)錄翻譯，且 LuxI 的表達也會隨著 OHHL 與 LuxR 的結(jié)合而了一個正反饋回路[17]。

軍事科學(xué)院碩士學(xué)位論文葡萄球菌為例[21]，主要以一種環(huán)八肽（圖 1-2）作為自誘導(dǎo)分子。細用 AgrD 蛋白合成前導(dǎo)肽，前導(dǎo)肽再被 AgrB 蛋白修飾加工并釋放到胞外的 AIP 濃度達到一定閾值時，AIP 將與其相應(yīng)的特異性受體蛋 結(jié)合，形成 AgrC-AIP 復(fù)合物，再將蛋白激酶 AgrA 磷酸化，磷酸化 AgrA 再與調(diào)節(jié)蛋白作用，目的基因被其激活，從而進行轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)

b上腺素和去甲腎上腺素的結(jié)構(gòu)AI-3 群體效應(yīng)的示意圖，還有一些已報道的其他信號分子，如 PQS, γ-丁內(nèi)酯(γ-butyrolactone)[29,30], CAI-1[31,32], 可nal factor)[33], 2- 氨 基 苯乙 酮 (2-AA ,2-amidiketopiperazine)[35],IQS[36]和 CSP (competen為“通用自誘導(dǎo)劑”，并且具有足夠研究背景， AIP 和 AI-1，AI-2 群體效應(yīng)抑制劑的研究較少群體效應(yīng)的信號分子結(jié)構(gòu)及其作用機制尚不明確究有助于發(fā)現(xiàn)更加廣譜的抑制劑，具有重要意義體效應(yīng)抑制劑的研究進展作用路徑可以發(fā)現(xiàn)，抑制 AI-2 群體效應(yīng)的途徑

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李曉玲;王sビ

本文編號：2822106