背景：腫瘤侵襲遷移是惡性腫瘤的主要特征之一,也是導致腫瘤治療失敗、腫瘤復發(fā)和病人死亡的主要原因之一,但是目前針對腫瘤侵襲遷移仍無有效的治療方法。中藥當歸龍薈丸用于治療慢性粒細胞性白血病有較好的療效,其活性成分靛玉紅有顯著的抗腫瘤活性。本室以靛玉紅的分子結(jié)構(gòu)為模板,設計、合成并篩選出一種有較高抗腫瘤活性、較低毒性的衍生物,將其命名為PHII-7。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),PHII-7呈現(xiàn)良好的廣譜抗腫瘤活性,對人慢性粒細胞白血病細胞株k562和k562/A02(k562多藥耐藥細胞株),人急性早幼粒細胞株HL60和HL60/ADR (HL60多藥耐藥細胞株),人乳腺癌細胞株MCF-7和MCF-7/ADR (MCF-7多藥耐藥細胞株)等有明顯細胞生長抑制作用。本文主要探究PHII-7體外對腫瘤細胞侵襲遷移的作用及其作用機制。 方法：本文以3株高侵襲遷移細胞株MDA-MB-231(人乳腺癌細胞株),MCF-7/ADR(人乳腺癌MCF-7多藥耐藥細胞株)和A549(人肺腺癌細胞株)作為研究對象,對PHII-7體外抑制腫瘤細胞侵襲遷移作用及作用機制進行研究。實驗方法如下：通過MTT法對腫瘤細胞增殖進行檢測；通過細胞計數(shù)法檢測細胞生長速率；通過細胞集落形成實驗測定細胞克隆形成能力和增殖能力；通過transwell實驗和劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移能力；通過流式細胞儀檢測細胞凋亡和壞死情況；通過realtimePCR實驗檢測基因mRNA水平表達；通過免疫印跡實驗(western blot)檢測基因蛋白水平表達。實驗結(jié)果為3次重復實驗結(jié)果,用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果：首先,實驗發(fā)現(xiàn)MCF-7/ADR細胞與MCF-7細胞相比有較強的侵襲性和遷移性,其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(EMT)特征明顯,EMT標記物E-cadherin表達明顯降低,而Slug, β-catenin和vimentin表達明顯增強。其次,PHII-7在低濃度條件下能有效地抑制腫瘤細胞侵襲和遷移,且呈明顯的濃度依賴性。PHII-7在高濃度條件下能有效地抑制細胞增殖和集落形成,對細胞生長抑制呈濃度依賴性和時間依賴性。PHII-7能誘導高侵襲遷移性細胞凋亡,主要是通過激活凋亡相關(guān)經(jīng)典信號通路caspase家族實現(xiàn)。進一步研究發(fā)現(xiàn),PHII-7抑制侵襲遷移作用機制與EMT過程有關(guān),PHII-7作用侵襲遷移性腫瘤細胞能有效增強其上皮細胞相關(guān)基因表達,降低間質(zhì)細胞相關(guān)基因表達,其中包括EMT標記基因E-cadherin, Slug, β-catenin和vimentin,表明PHII-7抑制腫瘤細胞侵襲遷移主要通過調(diào)控EMT相關(guān)基因表達實現(xiàn)。 結(jié)論：藥物治療一直是臨床常用的腫瘤治療手段,但其毒副作用較大。目前急需加快抗腫瘤藥物研發(fā),完善臨床治療策略。PHII-7是一種有研究價值的抗腫瘤衍生物,PHII-7不僅能增強耐藥腫瘤細胞對藥物的敏感性,抑制腫瘤細胞侵襲遷移,體內(nèi)外對腫瘤細胞生長也有顯著的抑制作用。對PHII-7抗腫瘤作用機制的研究為研發(fā)低毒高效的抗腫瘤藥物、臨床輔助治療藥物和分子靶向藥物提供重要數(shù)據(jù)。 背景：近年來抗腫瘤藥物發(fā)展迅速,尤其是針對有效靶點的抗腫瘤藥物。PHII-7是以傳統(tǒng)中藥當歸龍薈丸的活性成分靛玉紅為模板設計、合成的抗腫瘤衍生物。PHII-7體外有良好的廣譜抗腫瘤活性,能明顯抑制多種腫瘤細胞和耐藥細胞生長,但PHII-7具體作用機制仍不明確。實驗室前期對PHII-7的抗腫瘤作用機制進行了初步研究,利用化學修飾和蛋白組學方法研究發(fā)現(xiàn),PHII-7氨烷基側(cè)鏈衍生物體外可以與k562細胞裂解物中的α-烯醇化酶(ENO1)結(jié)合。為進一步探究PHII-7與其特異性結(jié)合的靶蛋白ENO1的關(guān)系,前期構(gòu)建和篩選了穩(wěn)定干擾ENO1的k562細胞系k562-shENO1及其對照細胞系k562-shC()N,本文對穩(wěn)定干擾ENO1細胞株進行了鑒定,旨在探究PHII-7作用機制及干擾ENO1后對PHII-7作用的影響。 方法：本文以2株穩(wěn)定干擾細胞株k562-shCON和k562-shENO1作為研究對象,對PHII-7體外作用機制進行研究。實驗方法如下：通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)；通過MTT法對腫瘤細胞增殖進行檢測；通過細胞計數(shù)法檢測細胞生長曲線；通過流式細胞儀檢測細胞凋亡和壞死情況；通過甲基纖維素半固體集落形成實驗檢測細胞克隆形成能力；通過流式細胞儀檢測細胞群中干細胞比例；通過realtimePCR實驗檢測基因mRNA水平表達；通過免疫印跡實驗(western blot)檢測基因蛋白水平表達；通過動物體內(nèi)腫瘤形成實驗檢測細胞生長和干性。實驗結(jié)果為3次重復實驗結(jié)果,用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果：穩(wěn)定干擾細胞株k562-shCON和k562-shENO1與k562細胞相比,形態(tài)無明顯改變,細胞生長為正常懸浮狀態(tài)。實驗發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定干擾ENO1后,k562細胞對PHII-7抑制細胞增殖作用更為敏感。通過細胞計數(shù)法檢測發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定干擾細胞株k562-shCON和k562-shENO1生長速率無明顯差異,但k562-shENO1對低濃度PHII-7抑制生長作用更敏感。PHII-7能誘導k562-shCON細胞和k562-shENO1細胞凋亡,主要通過激活凋亡相關(guān)經(jīng)典信號途徑caspase家族實現(xiàn)。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PHII-7能誘導k562-shCON細胞核和k562-shENO1細胞核裂解,且k562-shENO1細胞核裂解更明顯。動物體內(nèi)腫瘤形成實驗發(fā)現(xiàn),k562-shCON實驗組裸鼠腫瘤全部形成,且瘤體積較大；k562-shENO1實驗組裸鼠腫瘤形成比例較小,且瘤體積較小。 結(jié)論：通過化學修飾和蛋白質(zhì)組學研究方法發(fā)現(xiàn),PHII-7體外能與ENO1結(jié)合。通過進一步體外細胞學實驗發(fā)現(xiàn),在k562細胞內(nèi)干擾ENO1表達,能顯著增強PHII-7對細胞的殺傷作用,表明PHII-7在細胞內(nèi)的作用可能首先是通過抑制或影響ENO1功能實現(xiàn),但PHII-7作用機制和作用靶點還需進一步研究。對PHII-7作用機制和作用靶點的研究,將為新型抗腫瘤藥物設計和研發(fā)提供重要的數(shù)據(jù),并有利于對傳統(tǒng)抗腫瘤藥物當歸龍薈丸的進一步研究和臨床應用。 背景：藥物治療是臨床腫瘤治療常用方法之一,目前部分抗腫瘤藥物會產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象,如乳腺癌常用抗腫瘤藥物他莫昔芬。腫瘤耐藥的產(chǎn)生是腫瘤治療失敗的主要原因之一,也是腫瘤臨床治療的難題。研究表明,α烯醇化酶(ENO1)與腫瘤細胞耐藥產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān),耐藥腫瘤細胞中ENO1常呈異常表達狀態(tài)。本實驗旨在研究ENO1在人慢性粒細胞白血病多藥耐藥細胞株k562/A02中的作用。方法：通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,將pSilencer U6-shCON質(zhì)粒和pSilencer U6-shEN01質(zhì)粒轉(zhuǎn)入k562/A02細胞中,利用篩選標記潮霉素進行篩選和單克隆細胞培養(yǎng),構(gòu)建穩(wěn)定干擾ENO1的k562/A02-shENO1細胞株和對照k562/A02-shCON細胞株；通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)；通過MTT法對腫瘤細胞增殖進行檢測；通過細胞計數(shù)法檢測細胞生長曲線；通過流式細胞儀檢測細胞凋亡和壞死情況;通過甲基纖維素半固體集落形成實驗檢測細胞克隆形成能力；通過realtime PCR實驗檢測基因mRNA水平表達；通過免疫印跡實驗(western blot)檢測基因蛋白水平表達。實驗結(jié)果為3次重復實驗結(jié)果,用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果：與敏感性細胞株k562相比,ENO1在耐藥細胞株k562/A02表達增高,其在mRNA水平和蛋白水平表達分別增高(2.85±0.56)倍和(1.43±0.05)倍。k562/A02細胞生長速率與k562細胞相比無顯著性差異。本實驗成功篩選3株穩(wěn)定干擾ENO1的細胞株k562/A02-shENO1和對照細胞系k562/A02-shCON。3株k562/A02-shENO.1細胞與對照組k562/A02-shCON細胞相比生長速率均降低,對抗腫瘤藥物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增強。k562/A02-shENO1細胞對羅丹明123蓄積能力與對照組相比顯著性增強,同時k562/A02-shENO1細胞中耐藥相關(guān)基因MDR1表達水平在mRNA水平和蛋白水平均降低。甲基纖維素半固體集落形成實驗發(fā)現(xiàn),k562/A02-shENO1細胞中細胞克隆能力明顯降低。 結(jié)論：穩(wěn)定干擾ENO1表達不僅能抑制k562/A02細胞生長和降低細胞群中干細胞比例,還能增強k562/A02細胞對抗腫瘤藥物敏感性,降低其MDRl基因表達。實驗表明,ENO1與k562/A02細胞耐藥基因表達相關(guān),ENO1可以作為k562/A02細胞克服耐藥的靶點。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R96

【參考文獻】

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1 張瑩;李敏;劉宇;韓忷s

本文編號：2816526