【摘要】：隨著腫瘤發(fā)病率的逐年攀升,放射治療后引起的放射性腸損傷發(fā)病率也越來越高,目前對(duì)于急性放射性腸損傷的治療多采用綜合療法,相關(guān)藥物多無針對(duì)性及特異性,且療效欠佳,因此對(duì)于急性放射性腸損傷治療靶點(diǎn)和藥物的發(fā)現(xiàn)十分重要。已有研究表明,放射導(dǎo)致細(xì)胞凋亡是放射性腸炎形成的重要機(jī)制。小腸隱窩底部存在小腸干細(xì)胞,干細(xì)胞經(jīng)過大約3~5天即可分化成為小腸上皮其它所有細(xì)胞,隱窩干細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞對(duì)放射線十分敏感,受照射后,很快發(fā)生凋亡,阻斷或減少凋亡的發(fā)生有望成為急性放射性腸損傷的有效防治靶點(diǎn)。已有研究表明,胰高血糖素樣肽-2(Glucagon Like Peptide-2,GLP-2)可修復(fù)照射引起的急性放射性腸損傷,但本實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)照射后立即給予GLP-2,急性重度放射性腸損傷大鼠出現(xiàn)死亡時(shí)間早,死亡率高,表明單獨(dú)應(yīng)用GLP-2治療效果差。caspase-3在凋亡過程中有非常重要的作用,Ac-DEVD-CHO化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有醛基,加入氧化劑后,醛基中的碳?xì)滏I斷裂,氧化劑中的氧原子分別與碳和氫組成8個(gè)電子的共價(jià)鍵,形成更穩(wěn)定的羧基,在體內(nèi)更好發(fā)揮作用。因此本實(shí)驗(yàn)采用GLP-2和caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用來探討其保護(hù)作用及機(jī)制。并通過GLP-2和caspase-3激動(dòng)劑PAC-1聯(lián)合應(yīng)用反證其作用。實(shí)驗(yàn)方法:1.急性放射性腸損傷模型的建立大鼠麻醉后固定于自制木板上,暴露腹部,鉛磚屏蔽其他部位,~(60)Coγ射線進(jìn)行全腹部單次照射,劑量15Gy,建立急性放射性腸損傷模型。IEC-6細(xì)胞株,采用~(60)Coγ射線進(jìn)行照射,劑量10Gy,建立急性放射性腸損傷模型。2.GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于急性放射性腸損傷的保護(hù)作用研究Wistar雄性大鼠75只,隨機(jī)將其分為對(duì)照組(C組)、單純照射組(R組)、GLP-2組(G組)、GLP-2聯(lián)合激動(dòng)劑PAC-1組(P組)和GLP-2聯(lián)合抑制劑Ac-DEVD-CHO組(D組)共5組,每組15只。于照射后立即分別給予生理鹽水溶液、GLP-2溶液、PAC-1溶液和Ac-DEVD-CHO溶液,實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)各組大鼠一般狀態(tài)、體重和死亡率詳細(xì)記錄。分別于照射后1d、3d、5d和14d活殺取材,記錄腸長度及腸重量。HE染色觀察空腸、十二指腸和回腸組織結(jié)構(gòu)變化及空腸絨毛長度和隱窩深度,免疫組織化學(xué)法檢測空腸組織中Bmi-1的表達(dá)。選用IEC-6細(xì)胞株,照射前1h給予GLP-2溶液、PAC-1溶液和Ac-DEVD-CHO溶液,于照射后3h、6h和24h應(yīng)用CCK8法檢測IEC-6細(xì)胞的增殖情況。3.GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于急性放射性腸損傷的機(jī)制研究采用原位末端標(biāo)記、免疫印跡法檢測空腸組織中細(xì)胞凋亡和切割caspase-3、切割PARP-1的表達(dá),IEC-6細(xì)胞照射后3h應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測IEC-6細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于急性放射性腸損傷的保護(hù)作用研究GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高照射后大鼠生存率:照射后R組在第10天開始出現(xiàn)死亡,死亡率15%,G組于照射后第4天出現(xiàn)死亡,P組于照射后第1天就出現(xiàn)死亡,死亡率最高,而D組無死亡。GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用可減輕照射后大鼠小腸組織損傷:照射后第1天,R組出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞,G組損傷較R組輕,P組損傷較R組重,D組在所有組中損傷最輕;照射后第3天,R組腸絨毛縮短、倒伏、缺失,G組絨毛損傷及長度變化較R組輕,D組在所有組中最輕,恢復(fù)最好。照射后第5天,R組腸絨毛損傷及長度有所恢復(fù),G組較R組輕,P組較R組重,D組在所有組中最輕,恢復(fù)最好。照射后第14天,R組腸絨毛損傷及長度恢復(fù)至正常,G組較R組恢復(fù)好,P組恢復(fù)至正常,D組較C組、R組和P組恢復(fù)好GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用可減輕照射后大鼠空腸組織超微結(jié)構(gòu)損傷:照射后第3天,R組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞,微絨毛缺失,線粒體空化,嵴斷裂,G組損傷較R組輕,P組損傷較R組重,D組損傷最輕。GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用減少照射后大鼠空腸組織細(xì)胞凋亡:照射后第1天,R組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于C組,G組凋亡細(xì)胞數(shù)低于R組,P組顯著高于R組,D組低于R組和P組,但高于G組;照射后第3天,R組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于C組,G組低于R組,P組接近R組,D組顯著低于R組;照射后第5天,R組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于C組,G組低于R組,P組高于R組,D組顯著低于R組;照射后第14天,R組凋亡細(xì)胞數(shù)高于C組,G組低于R組,P組低于R組,D組顯著低于R組。GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用增加照射后大鼠空腸組織中Bmi-1表達(dá):照射后第1天,與C組比,R組Bmi-1的表達(dá)顯著降低;與R組比,G組顯著升高,D組顯著升高,G組和D組均顯著低于C組。照射后第3天,與C組比,R組Bmi-1的表達(dá)顯著降低;與R組比,G組顯著升高,D組顯著低于C組。照射后第5天,與C組比,R組降低;與R組比,D組顯著升高,P組顯著低于C組。照射后第14天,與C組比,R組降低;與R組比,D組組織中Bmi-1的表達(dá)顯著升高。GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用提高照射后IEC-6細(xì)胞增殖活力:照射后3h,與C組比,R組細(xì)胞增殖活力下降;與R組比,G組增殖活力顯著升高,P組增殖活力顯著降低,D組增殖活力顯著降低,P組和D組增殖活力也均低于C組。照射后6h,P組細(xì)胞增殖活力顯著低于C組和R組。照射后24h,與C組比,R組降低;與R組比,G組和P組均顯著降低,D組細(xì)胞增殖活力顯著升高,也顯著高于C組。2.GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于急性放射性腸損傷的機(jī)制研究GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用對(duì)照射后大鼠空腸組織中切割caspase-3和切割PARP-1的表達(dá)有影響:照射后第1天,與C組比,R組空腸組織中切割caspase-3表達(dá)升高,D組表達(dá)顯著高于C組。照射后第3天,R組表達(dá)降低,G組、P組和D組表達(dá)顯著降低。照射后第14天,各組的表達(dá)無差異。照射后第1天,與C組比,R組空腸組織中切割PARP-1表達(dá)升高;與R組比,P組的表達(dá)顯著升高,D組的表達(dá)也顯著升高。照射后第3天,與C組比,R組的表達(dá)顯著升高。照射后第14天,P組的表達(dá)顯著高于R組。GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用減少照射后IEC-6細(xì)胞凋亡:照射后3h,與C組比,R組晚期凋亡率顯著升高;與R組比,G組顯著降低。照射后3h,與C組比,R組早期凋亡率顯著升高;與R組比,G組和D組均降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P組高于R組。結(jié)論:1 GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于急性放射性腸損傷有保護(hù)作用,效果明顯優(yōu)于GLP-2單獨(dú)應(yīng)用。2 GLP-2和Ac-DEVD-CHO聯(lián)合應(yīng)用可能通過降低cleaved caspase-3和cleaved PARP-1的表達(dá)起保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2805028