【摘要】：真菌毒素污染農(nóng)作物和食品的現(xiàn)象普遍存在,嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。真菌毒素被攝入機(jī)體后,胃腸道組織首先暴露于這些真菌毒素。腸道是人體最大的消化器官,對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、機(jī)體健康的維持具有重要意義,同時(shí)也能抵抗有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后造成的損傷和功能障礙。這種屏障功能很大程度上取決于上皮細(xì)胞完整的結(jié)構(gòu)和有效的功能。真菌毒素等污染物被攝入后,腸上皮細(xì)胞的暴露水平高于其他組織;并且由于腸上皮細(xì)胞的代謝活性較強(qiáng),其容易受到真菌毒素更強(qiáng)烈的破壞。在諸多真菌毒素中,黃曲霉毒素(aflatoxins,AFs)毒性最強(qiáng)并且在世界范圍內(nèi)分布,其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是哺乳動(dòng)物中最強(qiáng)的致癌物質(zhì)之一,黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)是牛奶及各種奶制品中最主要存在也是目前唯一具有限量標(biāo)準(zhǔn)的真菌毒素。隨著人們對(duì)牛奶及奶制品消費(fèi)的增多,以及飲食結(jié)構(gòu)的復(fù)雜多樣化,人們暴露于AFB1和AFM1的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視,這也可能成為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的新內(nèi)容。但與單獨(dú)的AFB1和AFM1作用相比,二者聯(lián)合作用的潛在風(fēng)險(xiǎn)和毒性機(jī)理需進(jìn)一步研究揭示。因此,為了研究牛奶中特異存在的真菌毒素AFM1的毒性作用機(jī)理,以及AFM1和AFB1聯(lián)合對(duì)腸上皮細(xì)胞的毒性作用,本研究首先檢測(cè)了不同濃度的AFM1對(duì)分化Caco-2細(xì)胞活性的影響,并分析了Caco-2細(xì)胞暴露于AFM1后轉(zhuǎn)錄組水平的變化,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和文獻(xiàn)數(shù)據(jù),探究AFM1在不顯著降低細(xì)胞活性的濃度下對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性機(jī)理。然后探究了0.5~8μg/m L的AFM1和AFB1聯(lián)合處理分化Caco-2細(xì)胞48 h后對(duì)細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻值(TEER)、FITC-葡聚糖(4和40 kDa)的滲透率的影響;之后檢測(cè)了緊密連接蛋白mRNA水平和蛋白水平的變化,并通過(guò)免疫染色觀察緊密連接蛋白的定位情況;除此之外,還分析了AFM1和AFB1的交互作用類(lèi)型;探究了AFM1和AFB1導(dǎo)致緊密連接蛋白亞細(xì)胞定位改變的可能機(jī)制。主要結(jié)果如下:一,AFM1的細(xì)胞毒性具有劑量效應(yīng):高于4μg/mL時(shí)顯著降低細(xì)胞活性,低濃度下(0.0005和0.005μg/mL)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本的影響極小。趨勢(shì)分析表明差異基因主要富集到模塊0和3兩個(gè)下降的模塊中。在生物學(xué)進(jìn)程類(lèi)中,差異基因主要富集到細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程中;在分子功能類(lèi)中,差異基因主要富集到結(jié)合和催化活性上。STRING分析得出這些候選差異表達(dá)基因參與到細(xì)胞周期的調(diào)控中。篩選到的差異基因經(jīng)q-PCR驗(yàn)證,表達(dá)趨勢(shì)與RNA-seq的趨勢(shì)一致。AFM1能引起Caco-2細(xì)胞周期阻滯,并且與其所用劑量有關(guān)。細(xì)胞周期的變化和分布與細(xì)胞凋亡(DNA損傷)、細(xì)胞活性降低、細(xì)胞膜損傷無(wú)關(guān)。AFM1能引起細(xì)胞周期阻滯,并且CDK1、SOS1/Akt和AMPK信號(hào)分子參與其中。二,AFM1和AFB1聯(lián)合處理組的Caco-2細(xì)胞活性顯著低于對(duì)照組及單獨(dú)毒素處理組(p0.05)。AFM1能顯著降低分化Caco-2細(xì)胞TEER值,增加分化細(xì)胞單層的通透性,且具有劑量效應(yīng)。低濃度AFM1有促進(jìn)緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的趨勢(shì),高濃度的AFM1能降低分化Caco-2細(xì)胞中緊密連接蛋白mRNA水平和緊密連接蛋白豐度。TEER、FITC-葡聚糖(4和40 kDa)的滲透率和緊密連接蛋白表達(dá)量之間具有顯著相關(guān)性。AFM1和AFB1單獨(dú)及混合都會(huì)影響緊密連接蛋白的分布,并發(fā)現(xiàn)毒素處理后緊密連接蛋白出現(xiàn)一定程度的內(nèi)化——由膜定位變?yōu)榘|(zhì)定位。AFM1導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷會(huì)引起緊密連接蛋白定位的改變,并且網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用可能與毒素引起的緊密連接蛋白內(nèi)化現(xiàn)象有關(guān)。通過(guò)兩部分的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),高濃度的AFM1會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯,另外,AFM1與AFB1共存時(shí)毒性作用被增強(qiáng),導(dǎo)致分化Caco-2細(xì)胞之間的緊密連接被破壞,這些都表明了AFM1對(duì)分化Caco-2細(xì)胞的毒性作用。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R99
【圖文】：

圖 1-1AFB1 和 AFM1 的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig. 1-1 Chemical structure of AFB1 and AFM1全球范圍內(nèi)對(duì)糧食作物、飼料原料和飼料成品均造成嚴(yán)分析對(duì)畜牧行業(yè)以及動(dòng)物和人的健康是極其重要的。市場(chǎng) 289 個(gè) DDGS 樣本中的 AFB1 污染水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其中最高值為 79.60 μg/kg，2.5~20 μg/kg 梯度占比最高，016 年上半年對(duì)從沈陽(yáng)、內(nèi)蒙古、吉林和廣西等 8 個(gè)地區(qū) 36 個(gè)成品料樣品、21 個(gè)豆粕和麥麩樣品、35 個(gè)玉米樣中 AFB1 污染水平分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，AFB1 檢出率為 100%， 286.44 μg/L，成品料中 AFB1 最高含量為 40.7 μg/kg（王測(cè)發(fā)現(xiàn)，從市場(chǎng)上收集的 160 份樣品中 AFB1 在麥麩、豆出率都為 100%，其中麥麩樣品中的超標(biāo)率高達(dá) 38.1%，豬料和犬糧中的檢出率分別為 95.5%和 88.9%（龔阿瓊

AFB1 檢出率為 16.4%，并且玉米污染最為嚴(yán)重，其中 2013 年期間有 21.7%的樣品超過(guò)限量（Pleadin et al., 2015）。在 2010~2014 年，對(duì)意大利兩大地區(qū)飼料中的 AFB1污染監(jiān)測(cè)表明 AFB1 對(duì)飼料的污染情況呈季節(jié)性和年度性變化，而且是與氣候因素極其相關(guān)（Vita et al., 2016）。在對(duì)伊朗 210 個(gè)奶牛飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，從 88 個(gè)樣品中檢測(cè)出 AFB1，檢出率為 41.9%，污染水平 1.87~19.41 μg/ kg，其中 70 個(gè)樣品（33.3%）中的 AFB1 含量高于伊朗國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和歐盟委員會(huì)的限制（5 μg/kg）；苜蓿干草和玉米青貯的檢出率分別為 55.7%和 25.7%（Ehsani et al., 2016）。并且有研究利用建模方式預(yù)測(cè)未來(lái)100年在全球氣溫+ 2°C和+ 5°C情況下玉米和小麥作物中AFs 的污染，揭示了 AFB1 將成為未來(lái)歐洲玉米的食品安全問(wèn)題（Battilani et al.,2016）；AFs 對(duì)玉米和小麥的污染預(yù)測(cè)的地理參考網(wǎng)格點(diǎn)繪圖分別如圖 1-2 和圖 1-3所示。在當(dāng)前環(huán)境中，AFs 污染區(qū)域主要低于北緯 45°，溫度的升高明顯擴(kuò)大了玉米被污染的區(qū)域；在+ 5°C 的環(huán)境中，預(yù)測(cè)玉米被 AFs 污染的區(qū)域高達(dá)北緯 60°，比當(dāng)前玉米種植區(qū)的北部地理分布更廣。

圖 1-3 當(dāng)前、+ 2°C、+ 5°C 這 3 種不同氣候情景下，小麥中 AFs 污染的風(fēng)險(xiǎn)（Battilani et al.,2016）Fig. 1-3 Risk maps for aflatoxin contamination in wheat at harvest in 3 different climatescenarios, present, +2 °C, +5 °CAFM1 被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為 2B 類(lèi)致癌物（IARC, 2002）。它是全球范圍內(nèi)在牛奶中唯一確定最大殘留限量的真菌毒素：中國(guó)和美國(guó)為 0.5 μg/kg；歐盟（UN）、瑞士和土耳其的限量為 0.05 μg/kg。一些國(guó)家也對(duì)特定人群（例如嬰兒和 3 歲以下兒童）的特定乳制品中的 AFM1 污染水平發(fā)布了不同的限量標(biāo)準(zhǔn)（Iqbalet al., 2015），如表 1-1 所示。牛奶和奶制品中 AFM1 含量的監(jiān)測(cè)一直是各國(guó)關(guān)注的重點(diǎn)。在對(duì)歐洲、拉丁美洲、非洲及亞洲大部（東亞、中亞、南亞地區(qū)）的牛奶及奶制品 AFM1 污染水平的綜合統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，南亞國(guó)家和非洲國(guó)家的樣品中 AFM1的檢出率和污染水平最高，持續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)物飼料中的 AFs 污染水平極其重要以及在這些國(guó)家必須實(shí)施嚴(yán)格的真菌毒素限量法規(guī)（Iqbal et al., 2015）。Zheng（Zheng et al.,

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本文編號(hào)：2797653