【摘要】：目的:CPT-11(伊立替康)是治療腸癌的一線化療藥物。腹腔巨噬細胞與B1細胞是腹腔內(nèi)最重要的兩類組織定居的固有免疫細胞,兩者之間相互關聯(lián),共同維護胃腸固有免疫穩(wěn)態(tài)。此前的研究發(fā)現(xiàn),CPT-11對腸上皮和腹腔巨噬細胞有毒害作用。經(jīng)CPT-11化療后,藥物對腹腔固有免疫細胞的損傷,以及損傷后后是否可以自我修復尚不清楚。為此,在本課題中我們進行了四方面的研究:其一,檢測腹腔注射CPT-11對腹腔固有免疫細胞(包括腹腔巨噬細胞和B1細胞)表型和數(shù)量的影響;其二,同品系小鼠腹腔細胞和骨髓細胞過繼到CPT-11腹腔給藥處理后的小鼠后,檢測后者腹腔巨噬細胞和B細胞的表型和數(shù)量;其三,CPT-11灌胃處理,對腹腔巨噬細胞和B細胞數(shù)量的影響;其四,檢測CPT-11腹腔給藥處理對抵抗大腸桿菌Escherichia coli感染的免疫能力(生存率)的影響。旨在進一步明確CPT-11對固有免疫細胞的毒性作用,為有效減輕化療藥物的毒副作用、優(yōu)化化療方案提供實驗參考數(shù)據(jù)。方法:1.動物實驗:C57BL/6(6-8周齡)小鼠適應性養(yǎng)殖一周后,將小鼠分為3組,分別為Control組、Vehicle組和CPT-11組,其中CPT-11組腹腔注射CPT-11(200 mg/kg),Vehicle組注射等量溶劑,Control組不做處理。每組按藥物處理時間分亞組,各亞組分別為6只小鼠。CPT-11處理當天記為day0。繼續(xù)養(yǎng)殖,每天監(jiān)測小鼠體重變化情況,分別在day3,day7,day14,day28,day56,分別取其腹腔細胞,經(jīng)抗體標記后,利用流式細胞術檢測其數(shù)量和表型。其中小鼠腹腔巨噬細胞的表面標識分子為CD11b、F4/80和MHCⅡ,B細胞的表面標識分子為CD23和CD19。2.細胞實驗:取小鼠腹腔細胞,種在玻璃底的dish(5×10~5 cell/dish)中,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時至貼壁,吸棄未貼壁細胞,利用免疫熒光顯微技術檢測腹腔巨噬細胞的表面標識分子CD11b,F4/80和胞內(nèi)轉錄因子GATA6的表達情況。3.細胞過繼移植:取同品系正常的小鼠腹腔細胞和骨髓細胞,分別過繼到經(jīng)腹腔注射CPT-11處理7天后的小鼠體內(nèi)。過繼后三周檢測腹腔巨噬細胞和B細胞的數(shù)量和比例。4.細菌感染小鼠實驗:小鼠分成3組,分別為Control組、Vehicle組和CPT-11組。Control組不進行任何處理,Vehicle組腹腔注射溶劑,CPT-11組腹腔注射200 mg/kg的CPT-11懸濁液。7 d后,把亞致死劑量(1×10~9 CFU)大腸桿菌活菌懸液。每隔6 h觀察一次并且記錄小鼠的生存情況,連續(xù)觀察4天(總共觀察96 h)。5.組織化學觀察:將小鼠處死后,取出大小腸立即用4%的中性福爾馬林溶液固定,石蠟包埋切片后,用蘇木精-伊紅染色,用蔡司倒置顯微鏡,選擇Zeiss Axio Observer D鏡頭彩色CCD拍照獲取圖片。結果:1.小鼠腹腔注射CPT-11后,其腹腔巨噬細胞表型為CD11b~+F4/80~(hi)GATA6~+的大腹腔巨噬細胞(LPMs)在一周內(nèi)大量消失,但是14天后具有上述表型的細胞開始逐漸增加,說明該亞群細胞在自我恢復之中。然而,LPMs數(shù)量恢復的速度緩慢,停藥后兩個月(day56)LPMs的數(shù)量僅及Control或Vehicle對照小鼠LPMs數(shù)量的一半,說明CPT-11腹腔注射對腹腔巨噬細胞有明顯毒性作用,并且恢復過程漫長。2.CPT-11腹腔給藥后,腹腔內(nèi)B1和B2細胞的數(shù)量明顯下調(diào)。CPT-11處理3天后,小鼠體內(nèi)B細胞比例占腹腔細胞總數(shù)的比例下降至3%。但是56天后小鼠腹腔細胞中B細胞在數(shù)量上幾乎完全恢復正常。3.CPT-11腹腔注射處理一周后的小鼠進行同品系小鼠腹腔細胞和骨髓細胞過繼移植。在上述細胞移植后21天,分析小鼠體內(nèi)腹腔細胞的表型和細胞數(shù)量。結果顯示,LPMs(CD11b~+F4/80~hii MHCⅡ~(low))的比例和數(shù)量與對照組(只經(jīng)CPT-11處理的小鼠)相比都有明顯增加;而CPT-11處理后移植骨髓細胞的小鼠,其LPMs與對照組相比在數(shù)量上雖然也有所增加,但無統(tǒng)計學差異。值得一提的是,上述兩種細胞過繼移植小鼠中,其SPMs(CD11b~+F4/80~lowow MHCⅡ~(hi))的比例和數(shù)量與對照組相比均無明顯差異。4.隨后我們觀察了CPT-11腹腔給藥處理是否削弱小鼠抗細菌(大腸桿菌)感染的能力。CPT-11腹腔注射的小鼠,7天后腹腔注射大腸桿菌,與細菌感染對照組和空白對照組相比其存活率明顯下降。5.CPT-11灌胃對小鼠腹腔細胞同樣有損傷作用。小鼠經(jīng)400 mg/kg CPT-11連續(xù)灌胃兩次后,在day3檢測到腹腔巨噬細胞(LPMs和SPMs)和B細胞的比例雖然沒有明顯減少,GATA6陽性細胞的比例也沒有明顯變化,但是腹腔細胞的總數(shù)與正常對照小鼠腹腔細胞總數(shù)相比減少了約三分之一。除此之外,小鼠經(jīng)灌胃處理后從第四天開始陸續(xù)死亡,死亡前(day3)的解剖實驗發(fā)現(xiàn),其腸道上皮出現(xiàn)嚴重的水泡樣病變。另一組實驗采用400 mg/kg CPT-11灌胃一次后,與對照組小鼠相比,CPT-11處理的小鼠腹腔細胞總數(shù)在day7和day14也減少到~9×10~5(與Control組相比減少了大約三分之一)。以上結果說明口服CPT-11對腹腔固有免疫細胞的損傷作用(與腹腔注射相比)稍弱,但對腸道上皮的直接損傷作用很大。結論:CPT-11對腹腔巨噬細胞和B細胞有長期毒性,并且受損的腹腔巨噬細胞和B1細胞(屬于固有免疫細胞)恢復過程較慢。過繼移植同品系小鼠腹腔細胞可以加快腹腔固有免疫細胞的恢復,因此有望借此方法加速化療病人腹腔固有免疫穩(wěn)態(tài)的恢復過程。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R965
【圖文】：

圖 1.1 CPT-11 與 SN-38 異構體的 pH 依賴性平衡。Figure 1.1 The pH dependence of CPT-11 and SN-38 isomers is balanced. Underphysiological pH, the lactone rings of CPT-11 and SN-38 can be hydrolyzed intocarboxylic isomers. The acidic environment, mainly in the form of lactone, is theactive form of the drug.1.2 CPT-11 代謝過程CPT-11 被兩種羧基酯酶同工酶（CES1 和 CES2）和丁酰膽堿酯酶在人體內(nèi)水解成活性代謝物 SN-38（如圖 1.2）。CES1 和 CES2 主要分布于肝、結腸、腎和血細胞，而丁酰膽堿酯酶主要存在于血漿中[16]。這些酯酶的轉化主要發(fā)生在肝內(nèi)，是一個相對緩慢和低效的過程，因為只有 2-5%的 CPT-11 被轉化為 SN-38[17,

圖 1.2 CPT-11 的代謝和排泄過程圖[6]。CPT-11 經(jīng)過靜脈注射到血液，部分被血液中的羧基酯酶（CES）和丁酰膽堿酯酶水解成活性代謝物 SN-38，由有機陰離子轉運多肽（OATP）1B1 轉運體將 SN-38 主動轉運到肝臟。CPT-11 還被肝內(nèi)細胞色素 P 450（CYP 450）酶，即 CYP3A4 和 CYP3A5 代謝為非活性代謝物 APC和 NPC，NPC 可以在肝臟中由 CES1 和 CES2 轉換為 SN-38�；蛘弑桓闻K中的CES1/2 水解為活性形式 SN-38。SN-38 經(jīng)葡萄糖醛酸氧化后，被尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UGT）滅活至 SN-38G，并排出膽汁中[22]。腸道細菌產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶可將 SN-38G 解離為 SN-38，從而導致 SN-38 的腸肝循環(huán)。Figure 1.2 Irinotecan metabolism and excretion. The prodrug irinotecan is hydrolyzed intothe active metabolite SN-38 by two isoforms of carboxylesterases (CES1 and CES2) andbutyrylcholinesterase in the human body.

圖 3.1 CPT-11（200mg/kg）可以快速清除腹腔常駐巨噬細胞。C57BL/6 雌性小鼠分成五批（五個時間段），每批三組：Control 組不處理，Vehicle 組腹腔注射溶劑，CPT-11 組腹腔注射 CPT-11（CPT-11 用量按照小鼠體重 200 mg/kg 計算，注射體積 500 μL/18g），CPT-11 注射當天記為 day0。在 day3 和 day7 分別處死一批小鼠，取腹腔細胞，計數(shù)后，相應抗體染色，用流式細胞術檢測其細胞表型。（A）采用 FlowJo10.0 對腹腔巨噬細胞分析過程圖展示，在 CD11b 陽性細胞群中圈出 LPMs（F4/80hiMHCIIlow）和 SPMs（F4/80lowMHCIIhi）細胞群。（B）CPT-11處理 3 天和 7 天后的流式檢測結果。（C）是對（B）的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，n=6，***表示 P < 0.001；ns 表示無統(tǒng)計學差異。Figure 3.1 CPT-11 treatment rapidly reduced the numbers of peritonealresident macrophages. C57BL/6 were grouped according to their non-treatment

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本文編號：2795433