發(fā)布時間：2020-08-11 16:59

【摘要】：【研究背景】Cathelicidin抗菌肽是一類具有廣譜抗菌活性的陽離子肽。Cathelicidin抗菌肽目前僅一種,在小鼠為CRAMP,在人為LL-37。Cathelicidin主要由組織細胞(如上皮細胞)和免疫細胞(如中性粒細胞等)表達。Cathelicidin抗菌肽通過正負靜電吸引作用結(jié)合并破壞帶負電的細菌胞壁或膜結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮抗菌功能。因此Cathelicidin還具有抵御有包膜病毒如呼吸道合胞病毒、流感病毒的功能。然而,Cathelicidin抗菌肽對于非包膜病毒的作用及機制研究甚少。B3柯薩奇病毒(Coxsackievirus B3,CVB3)是引起病毒性心肌炎(Viral Myocarditis,VMC)的非包膜小RNA病毒。我們實驗室先期研究發(fā)現(xiàn),抗菌肽cathelicidin能在體內(nèi)外顯著抑制非包膜病毒CVB3在心肌細胞的復(fù)制,顯著減輕CVB3誘導的急性心肌炎。為闡明cathelicidin抗非包膜病毒的機制,我們在體外原代心肌細胞證實外源加入cathelicidin具有劑量依賴的抗病毒作用。然而,隨后在CVB3感染機體的初始組織-腸道上皮細胞HCT116和CVB3研究常用宮頸癌上皮細胞系Hela中的試驗,卻意外發(fā)現(xiàn)外源加入抗菌肽cathelicidin可劑量依賴地顯著促進CVB3在上皮細胞的復(fù)制。CVB3是腸道病毒,感染人體時首先感染腸道上皮細胞,隨后經(jīng)大網(wǎng)膜入血后再后續(xù)感染胰腺和心臟誘導心肌炎和胰腺炎,因此CVB3在腸道上皮細胞的復(fù)制是整個CVB3感染致病的首要過程,對后續(xù)多臟器的CVB3感染復(fù)制和炎癥疾病有顯著的影響。而抗菌肽cathelicidin又是上皮細胞等分泌的抗感染固有免疫效應(yīng)分子。則我們認為cathelicidin顯著促進CVB3在腸道上皮細胞的復(fù)制是一個重要的科學問題。需要深入研究和機制探討。本課題聚焦cathelicidin抗菌肽對于非包膜病毒CVB3的作用及其分子機制,特別專注于我們發(fā)現(xiàn)的cathelicidin抑制心肌細胞內(nèi)CVB3復(fù)制然而促進腸道上皮細胞內(nèi)CVB3病毒復(fù)制的反常規(guī)現(xiàn)象,擬首先通過外源加入cathelicidin抗菌肽和CRISPR/Cas9敲除細胞內(nèi)源性cathelicidin明確cathelicidin促進腸上皮細胞CVB3復(fù)制的現(xiàn)象。進一步,將對病毒感染細胞和復(fù)制的多個步驟及相關(guān)細胞自噬、凋亡等行為進行研究,試圖闡明cathelicidin抗菌肽促進腸道上皮細胞CVB3復(fù)制的分子機制。本研究系首次發(fā)現(xiàn)和研究抗菌肽促進病毒復(fù)制的現(xiàn)象和機制,有助于揭示抗菌肽在非包膜病毒感染上皮細胞的作用和機制,從而為闡明CVB3誘導的急性病毒性心肌炎機制提供新的切入點和思路;同時為抗菌肽在抗病毒免疫治療的應(yīng)用提供新視點�！灸康摹棵鞔_抗菌肽cathelicidin促進腸道上皮細胞內(nèi)CVB3復(fù)制的現(xiàn)象及分子機制。【研究方法】1.原代心肌細胞的培養(yǎng):取出生24小時乳鼠心臟,以膠原酶II和透明質(zhì)酸酶37℃消化2~3輪,將消化獲得細胞通過差速貼壁法獲得心肌細胞,以DMEM-10%FBS培養(yǎng)24hr備用。2.腸道上皮細胞的培養(yǎng):結(jié)腸癌上皮細胞HCT116以DMEM-10%FBS 37℃培養(yǎng)。胰蛋白酶消化傳代。3.CVB3體外細胞感染試驗:以100μl CVB3(MOI=10)感染細胞,37℃1小時,棄液,無菌PBS洗一遍,DMEM-2%FBS維持液維持。4.CVB3復(fù)制蛋白水平的檢測:蛋白免疫印跡檢測CVB3衣殼蛋白VP1:CVB3感染細胞以預(yù)冷RIPA裂解,上清蛋白測濃度后煮沸。蛋白樣品行SDS-PAGE電泳,條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%BSA封閉2 h。兔抗VP1抗體4℃孵育過夜;二抗室溫孵育1.5 h,ECL化學發(fā)光顯色,膠片壓片,顯影定影。5.CVB3復(fù)制RNA水平的檢測:熒光定量PCR檢測CVB3正負鏈:RNAiso提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)成cDNA,SYBR Green實時定量PCR。2~(-??CT)方法計算病毒正負鏈的相對表達。6.CVB3活性顆粒的效價檢測:TCID_(50)方法檢測病毒效價:細胞培養(yǎng)上清按10~(-1)-10~(-10)稀釋,加30μl至Hela細胞,每天觀察,半數(shù)細胞折光性變差、皺縮、浮起50時判為病變。按照TCID_(50)=lg(大于50%病變陽性率的稀釋度)+(大于50%病變陽性率的百分數(shù)-50)/(大于50%病變陽性率的百分數(shù)-小于50%病變陽性率的百分數(shù))。將30μl病毒液數(shù)值換算為100μl病毒液數(shù)值。換算PFU/ml≈TCID50/ml%s0.7。7.CRISPR/CAS9技術(shù)敲除細胞內(nèi)源性cathelicidin:HCT116細胞構(gòu)建嘌呤霉素抗性的cas9細胞株,篩選陽性克隆,用設(shè)計的LV-sgRNA感染cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株,熒光篩選胞內(nèi)敲除cathelicidin。8.病毒吸附細胞和穿入細胞的檢測:吸附試驗:4℃預(yù)冷,CVB3(MOI=20)感染細胞,同時加LL37,4℃置1h使病毒結(jié)合細胞無法進入胞內(nèi)。棄上清洗三遍,加DMEM-10%FBS繼續(xù)培養(yǎng)18h收細胞蛋白。病毒穿入細胞試驗:4℃預(yù)冷,CVB3(MOI=20)感染細胞,4℃置1h使吸附,棄上清洗三遍,加DMEM-10%FBS,同時加LL37,37℃培養(yǎng)1h,棄上清洗三遍,DMEM-10%FBS 37℃培養(yǎng)18h收細胞蛋白。9.細胞自噬的檢測:蛋白免疫印跡檢測自噬相關(guān)蛋白LC3:CVB3感染細胞0,2,4,6,8h收細胞蛋白。SDS-PAGE,轉(zhuǎn)PVDF膜,5%BSA封閉;兔抗LC3I/II抗體4℃孵育過夜;二抗孵育1.5 h,ECL化學發(fā)光顯色。免疫熒光檢測LC3:CVB3感染細胞6h棄上清,4%多聚甲醛室溫固定15分鐘,0.25%TRITON?X-100破膜5分鐘,10%BSA封閉30分鐘,兔抗LC3I/II抗體37℃孵育2小時,二抗37℃ 45分鐘。DAPI室溫10分鐘染胞核,激光共聚焦顯微鏡下觀察。10.流式檢測細胞凋亡:重懸CVB3感染細胞,加Annexin V-APC和7-AAD,室溫避光孵育15分鐘。上機檢測。11.蛋白免疫印跡檢測ERK信號通路和AKT信號通路相關(guān)蛋白:CVB3感染HCT116細胞0~18hr,收細胞蛋白,SDS-PAGE,轉(zhuǎn)PVDF膜,以ERK,p-ERK,AKT,p-AKT,mTOR,p-mTOR等抗體檢測相關(guān)蛋白。12.統(tǒng)計方法:數(shù)據(jù)均以均值±標準差表示;組間比較采用方差分析;分析以GraphPad Prism 5和SPSS 11軟件完成,P0.05存在顯著性差異�！窘Y(jié)果】1.5~20μg/mL的LL37和CRAMP抗菌肽對細胞無毒性。2.以CVB3感染(MOI=10)原代心肌細胞,外源加入Cathelicidin抗菌肽可劑量依賴地抑制CVB3在原代心肌細胞的復(fù)制。2、Cathelicidin抗菌肽可劑量依賴地顯著促進CVB3在腸道上皮細胞HCT116的復(fù)制。以GFP-CVB3或CVB3感染(MOI=10)HCT116,同時加入5~20μg/m L抗菌CRAMP和LL37,以亂序無功能的s LL-37與sCARMP為對照,發(fā)現(xiàn):1)流式檢測GFP陽性細胞證實:CRAMP和LL37均可劑量依賴地促進胞內(nèi)熒光CVB3的增加;2)CVB3感染18小時,western blot檢測CVB3衣殼蛋白VP1水平,發(fā)現(xiàn)LL37和CRAMP顯著上調(diào)VP1表達,且具有劑量依賴性;3)感染18小時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)2種抗菌肽顯著提高CVB3的RNA復(fù)制與載量;4)細胞上清TCID50試驗發(fā)現(xiàn)20μg/m L的LL37和CRAMP可使CVB3在HCT116產(chǎn)生的活性病毒顆粒效價由10~5pfu顯著上升至10~7 pfu。證實Cathelicidin抗菌肽可劑量依賴地促進CVB3在腸道上皮細胞的復(fù)制。3、Cathelicidin抗菌肽顯著促進了CVB3在人宮頸癌上皮細胞HeLa、人肺癌上皮細胞A549和人腎上皮細胞HepG-2的復(fù)制,提示Cathelicidin抗菌肽促進CVB3在上皮細胞的復(fù)制。4、CVB3感染腸道上皮細胞HCT116自4小時起,顯著上調(diào)了腸上皮細胞內(nèi)源性Cathelicidin抗菌肽的表達。5、以CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)建立穩(wěn)定敲除cathelicidin的HCT116-Cas9細胞株,再感染CVB3發(fā)現(xiàn):內(nèi)源性cathelicidin敲除后,CVB3感染18小時的衣殼蛋白VP1表達量顯著降低,病毒RNA復(fù)制量和載量顯著減少,上清活性病毒顆粒效價顯著降低。再次證實:Cathelicidin抗菌肽可顯著促進CVB3在腸道上皮細胞的復(fù)制。6、從病毒細胞感染細胞過程探討了cathelicidin抗菌肽促進腸道上皮細胞CVB3復(fù)制的分子機制,發(fā)現(xiàn):通過4℃條件CVB3孵育細胞1hr同時加抗菌肽(病毒吸附)隨后棄上清再培養(yǎng)試驗,和4℃條件CVB3孵育細胞1hr后棄上清、再加抗菌肽37℃孵育1hr、再培養(yǎng)試驗(病毒穿入細胞),發(fā)現(xiàn)cathelicidin能促進CVB3的吸附細胞和穿入細胞的過程。7、CVB3感染細胞誘導細胞自噬促進病毒復(fù)制,但在感染0~8hr,抗菌肽cathelicidin的加入不影響CVB3誘導的LC3I/LC3II比例上調(diào)即自噬發(fā)生。8、流式細胞術(shù)檢測Annexin V+7-AAD-早期凋亡細胞,發(fā)現(xiàn)抗菌肽cathelicidin促進CVB3感染細胞發(fā)生早期凋亡。9、CVB3感染過程伴隨ERK磷酸化增加,抗菌肽cathelicidin的加入在前期增強p-ERK的激活,ERK信號通路抑制劑U0126顯著抑制LL37作用下CVB3復(fù)制,提示抗菌肽影響ERK通路激活。10、CVB3感染激活A(yù)KT信號通路啟動病毒RNA的轉(zhuǎn)錄翻譯。發(fā)現(xiàn):CVB3感染4hr時p-AKT尚未激活無VP1蛋白表達;感染6hr才誘導p-AKT和病毒VP1表達;加入cathelicidin抗菌肽不僅在6hr時顯著增強p-AKT激活、上調(diào)VP1蛋白水平;在感染4h就已顯著上調(diào)p-Akt水平、從而提前啟動了Akt通路激活介導的病毒RNA轉(zhuǎn)錄。提示抗菌肽cathelicidin能提前激活胞內(nèi)AKT通路,顯著促進CVB3的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制�！窘Y(jié)論】1、抗菌肽cathelicidin在體內(nèi)外均顯著抑制CVB3在原代心肌細胞的復(fù)制,但是可顯著促進CVB3在腸道上皮細胞的體外復(fù)制。2、敲除腸道上皮細胞內(nèi)源性cathelicidin,可顯著降低CVB3的復(fù)制。3、抗菌肽cathelicidin促進CVB3在腸道上皮細胞內(nèi)的復(fù)制的分子機制,主要通過促進病毒吸附和穿入細胞、促進腸道上皮細胞的早期凋亡、增強早起ERK磷酸化、提前激活胞內(nèi)Akt磷酸化、促進CVB3的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制來實現(xiàn)。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R96
【圖文】：

cathelicidin 促進腸道上皮細胞內(nèi)無包膜病毒 CVB3 復(fù)制的作用和機制探討 第實驗數(shù)據(jù)均以均值±標準差表示；組間比較采用方差分析；統(tǒng)計分hPad Prism 5 和 SPSS 11 軟件完成，P<0.05 被認為存在顯著性差異。3. 結(jié)果3.1 cathelicidin 抗菌肽顯著抑制 CVB3 在乳鼠原代心肌細胞中的復(fù)制取乳鼠的原代心肌細胞，鋪板 24 小時至完全貼壁，光鏡下可見細胞有動。用 10μL CVB3（MOI=10）感染細胞，同時加入 20μg/ mL LLMP，感染 1 小時棄上清，加入含 抗菌肽的 2%FBS DMEM 維持液培養(yǎng)8 小時 Western Blot 檢測病毒衣殼蛋白 VP1 的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LLMP 在原代心肌細胞中具有顯著抑制 CVB3 復(fù)制的作用（圖 1.1）。這與MP KO 小 鼠 的 體 內(nèi) 抗 病 毒 結(jié) 果 一 致 ， 提 示 cathelicidin 抗RAMP/LL37）具有抑制 CVB3 在心肌細胞內(nèi)復(fù)制的作用。

圖 1.2 實驗用的抗菌肽 cathelicidin 濃度對細胞無毒性Figure1.2 cathelicidin concentration is safe for HT116 cells3.3 cathelicidin 劑量依賴性地促進 CVB3 在腸道上皮細胞 HCT116 的復(fù)制為詳細研究抗菌肽 cathelicidin 體外對 CVB3 在腸道上皮細胞系 HCT116 中復(fù)制的影響，采用以下 4 種方法對 CVB3 產(chǎn)出、VP1 蛋白表達、RNA 復(fù)制和活病毒效價進行了檢測。3.3.1 GFP-CVB3 感染 HCT116 試驗證實抗菌肽促進 CVB3 在腸上皮細胞的病毒產(chǎn)出取生長良好的 HCT116 細胞，用 10μL帶綠色熒光的 GFP-CVB3（MOI=10）感染細胞，同時分別加入 5、10 以及 20μg/ mL 的 LL37 和 CRAMP 抗菌肽以及20μg/ mL 陰性對照 sLL-37 與 sCARMP（與 LL-37 和 CRAMP 含有相同的氨基酸，其氨基酸排列順序為亂序）。CVB337℃感染 1 小時棄上清，洗三遍后加

GFP-CVB3感染HCT116細胞觀察熒光病毒的產(chǎn)出Figure1.3GenerationofGFP-CVB3afterinfectionofHCT116cellwithGFP-CVB3

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本文編號：2789328