【摘要】：研究背景:隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展,由人類經(jīng)濟活動產(chǎn)生的水體富營養(yǎng)化及其所造成的水華暴發(fā)成為全球關注的重要環(huán)境問題。水華暴發(fā)時,大量繁殖的藻類所產(chǎn)生的次生代謝物微囊藻毒素(microcystins,MCs)對水生生物和人類具有健康威脅。在超過100種的MCs異構體中,微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)是最為常見且毒性最強的一種,肝臟是其主要的靶器官。MC-LR可以引發(fā)一系列的肝毒性,包括誘導肝細胞壞死、凋亡、肝出血等。目前認為,MC-LR的主要致毒機理是通過抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2 A,PP2 A)的活性從而產(chǎn)生一系列的細胞毒性作用。PP2A是細胞內(nèi)主要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶,參與了包括細胞骨架動態(tài)調(diào)控在內(nèi)的多種細胞生命活動。α4是PP2A 一個重要的調(diào)節(jié)蛋白,它能對PP2A進行多種調(diào)節(jié),包括調(diào)節(jié)PP2A活性和促進PP2A核心酶組裝。α4的過表達能夠促進細胞增殖和細胞存活。α4還對細胞骨架具有一定調(diào)節(jié)作用。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)MC-LR能夠在多種細胞系中誘導細胞骨架發(fā)生重構,這可能與其抑制PP2A活性有關。隨后,我們在人胚腎293細胞(HEK293)內(nèi)觀察到低濃度MC-LR引發(fā)了 PP2A活性應激性上調(diào),這一現(xiàn)象可能與α4和PP2A/C亞基結合的改變有關,暗示α4參與了對MC-LR細胞毒性效應的調(diào)節(jié)過程。將HEK293細胞內(nèi)α4蛋白過表達后,本實驗室最近還觀察到MC-LR對細胞骨架的破壞作用消失了,提示在MC-LR毒性效應下α4的過表達提高了 HEK293內(nèi)細胞骨架的穩(wěn)定性,這引發(fā)了我們?nèi)绻谄渌毎抵羞^表達α4是否具有同樣效應的思考。本實驗將探究MC-LR處理α4過表達的人肝細胞系7702(HL7702)后產(chǎn)生的各種細胞效應,這有助于更好地闡明MC-LR毒性效應下α4,PP2A和細胞骨架的關系。研究方法:利用lipofectamineTM2000將α4表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入HL7702內(nèi)24h后,再分別用不同濃度的MC-LR(0μM,1μM和10μM)處理24h�？蛰d質(zhì)粒作為空載對照組。應用酶活性測定試劑盒、免疫印跡技術、免疫熒光技術和免疫共沉淀技術對本實驗條件下產(chǎn)生的各種細胞效應和相關分子變化進行檢測。研究結果:MC-LR染毒α4過表達的HL7702后:PP2A活性受到顯著抑制;PP2A亞基蛋白水平和PP2A/C亞基的翻譯后修飾水平受到影響,如PP2A/C亞基表達上調(diào),PP2A/C亞基Y307位點磷酸化水平升高,PP2A/C亞基L309位點甲基化水平降低;PP2A/C亞基和α4的結合以及PP2A/C亞基和PP2A/A亞基的結合均顯著下降;PP2A 活性受到抑制的同時,p-ERK(T202/Y204),p-JNK(T183/Y185)和p-P38(T180/Y182)磷酸化水平顯著上升,表明三條MAPK通路同時被激活;細胞內(nèi)微絲,微管和中間纖維形態(tài)和分布沒有發(fā)生變化,細胞骨架結構穩(wěn)定,而骨架相關蛋白VASP(S157)和Ezrin(T567)磷酸化水平上調(diào),VASP(S239)磷酸化水平下調(diào)。研究結論:α4過表達后,MC-LR仍然抑制了 HL7702細胞的PP2A活性,其作用方式可能是改變PP2A/C亞基蛋白水平及其翻譯后修飾水平,改變PP2A/C亞基和α4的結合以及PP2A/C亞基和PP2A/A亞基的結合;與未過表達α4的HL7702細胞類似,ERK1/2,P38和JNK三條通路依然被激活;α4的過表達在一定程度上拮抗了 MC-LR對骨架的破壞作用,與骨架相關蛋白VASP(S157),VASP(S239)和Ezrin(T567)的磷酸化水平改變有關;α4過表達的HL7702細胞對MC-LR的響應與α4過表達的HEK293中類似,但機制有所不同。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R99
【圖文】：

學碩士學位論文邐實驗結果逡逑邋ＭＣ－ＬＲ處理ａ４過表達的ＨＬ７７０２細胞后ＰＰ２Ａ亞基蛋白水平及翻譯后修飾的逡逑應用免疫印跡法檢測ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基和ＰＰ２Ａ／Ａ亞基的表達情況。結果如圖４．２．２，ｃｘ４過表達后，隨著染毒濃度的增大，ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基的表達逐漸升高，在最高逡逑濃度Ｐ１０組中出現(xiàn)了顯著升高。ＰＰ２Ａ／Ａ亞基的表達水平在各組中都沒有發(fā)生逡逑改變。ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基上３０７位點酪氨酸（Ｙ３０７）的磷酸化水平以及３０９位點亮逡逑（Ｌ３０９）的甲基化水平也有一定改變，隨著ＭＣ－ＬＲ染毒濃度的增大，ｐ－ＰＰ２Ａ／Ｃ３０７）的磷酸化水平上升，在最高染毒濃度Ｐ１０組中出現(xiàn)了顯著升高，而逡逑Ｐ２Ａ／Ｃ邋（Ｌ３０９）的甲基化水平下降，在最高染毒濃度Ｐ１０組中出現(xiàn)了顯著下降。逡逑

浙江大學碩士學位論文邐實驗結果逡逑４．２．３邋ＭＣ－ＬＲ邋處理ａ４邋過表達的邋ＨＬ７７０２邋細胞后造成邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋和ｃｔ４，邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋和邋ＰＰ２Ａ／Ａ逡逑解離逡逑采用免疫共沉淀法，本研究檢測了細胞中ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基和ａ４以及ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基逡逑和ＰＰ２Ａ／Ａ亞基結合水平的變化。結果如圖４．２．３所示，ａ４過表達后，隨著ＭＣ－ＬＲ逡逑染毒濃度的升高，ａ４與ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基的結合降低，在最高染毒濃度Ｐ１０組中結合逡逑水平顯著降低。另一方面，ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基和ＰＰ２Ａ／Ａ亞基的結合也隨著ＭＣ－ＬＲ染逡逑毒濃度的升高而降低，在最高染毒濃度Ｐ］0組中結合水平顯著降低。逡逑

解離逡逑采用免疫共沉淀法，本研究檢測了細胞中ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基和ａ４以及ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基逡逑和ＰＰ２Ａ／Ａ亞基結合水平的變化。結果如圖４．２．３所示，ａ４過表達后，隨著ＭＣ－ＬＲ逡逑染毒濃度的升高，ａ４與ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基的結合降低，在最高染毒濃度Ｐ１０組中結合逡逑水平顯著降低。另一方面，ＰＰ２Ａ／Ｃ亞基和ＰＰ２Ａ／Ａ亞基的結合也隨著ＭＣ－ＬＲ染逡逑毒濃度的升高而降低，在最高染毒濃度Ｐ］0組中結合水平顯著降低。逡逑Ｉｎｐｕｔ邐ＩｇＧ邐Ｖｅｃ邐Ｐ０邐ＰＩ邐Ｐ１０逡逑ａ４邐ｍｕＭｉｎｉ灥逡逑ＰＰ？Ａ／ｒ邐４Ｍｍｉｍ邐ｆｌＨＢＩ逡逑Ｊｒ邋－ｉ邋ｚ＾ｊｔ＼Ｊ邋ｖ＿邐邐邋邐－邐．邋１邐＇＊＇＇＇？逡逑ｐｐ遍邐————逡逑ｐｐ＊＾ａ／ｃ逡逑圖４．２．３邋ＭＣ－ＬＲ對ａ４過表徸的ＨＬ７７０２細胞內(nèi)ＰＰ２Ａ／Ｃ和ｃｔ４，邋ＰＰ２Ａ／Ｃ和ＰＰ２Ａ／Ａ結合的逡逑影響。＊，ｐ＜0．0５；邋＊＊，ｐ＜０．０１；邋＊＊＊，邋ｐ＜０．００１；邋ｎ＝３逡逑Ｆｉｇ．邋４．２．３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ＭＣ－ＬＲ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｏｆ邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋ａｎｄ邋ａ４邋ａｓ邋ｗｅｌｌ邋ａｓ邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋ａｎｄ逡逑ＰＰ２Ａ／Ａ邋ｉｎ邋ａ４－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ邋ＨＬ７７０２邋ｃｅｌｌｓ．邋＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，邋ｐ＜０．０１；邋＊＊＊，邋ｐ＜０．００１；邋ｎ＝３逡逑２０逡逑

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 林抒豪;石玉秀;韓芳;;細胞凋亡與真核細胞骨架蛋白相關性的研究進展[J];解剖科學進展;2015年02期

2 黃曉淳;駱和東;黃培枝;洪華榮;;我國水源水及飲用水中微囊藻毒素的污染現(xiàn)狀及影響因素研究[J];環(huán)境衛(wèi)生學雜志;2014年05期

3 LU Jing;LI Ting;HE RongQiao;BARTLETT Perry F;GTZ Jürgen;;Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus[J];Science China(Life Sciences);2014年04期

4 ;Effect of microcystin-LR on protein phosphatase 2A and its function in human amniotic epithelial cells[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2011年12期

本文編號：2788749