【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)是廣泛分布于細(xì)胞表面的七次跨膜蛋白,它由胞外區(qū)(Extracellular domain,ECD)、跨膜區(qū)(Transmembrane domain,TMD)和胞內(nèi)區(qū)組成。其中ECD主要和配體的識別與結(jié)合相關(guān),配體與受體結(jié)合后可引起第六個跨膜螺旋(The 6~thh transmembrane helix,TM6)等的扭轉(zhuǎn)和外移,從而為下游G蛋白提供結(jié)合空間。GPCRs可通過G蛋白和Arrestin等效應(yīng)蛋白進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。B類GPCRs是體內(nèi)多種激素的受體,相比于其他GPCRs家族,B類受體有一個較大的胞外區(qū)。這一特點使得B類GPCRs較難表達(dá)純化,因此加大了該家族受體結(jié)構(gòu)解析的難度。作為重要的藥物靶點,B類GPCRs可以調(diào)控包括糖尿病、肥胖、骨質(zhì)疏松和心血管疾病在內(nèi)的多種疾病。本論文的主要研究對象1型甲狀旁腺激素受體(The parathyroid hormone receptor-1,PTH1R)和2型甲狀旁腺激素受體(The parathyroid hormone receptor-2,PTH2R)都屬于B類GPCRs。前者主要調(diào)控機體的鈣穩(wěn)態(tài)和骨代謝,其功能異�？梢鸸琴|(zhì)疏松等疾病。后者主要在中樞神經(jīng)表達(dá),可調(diào)控情緒、體溫、細(xì)胞增殖和心血管功能等。盡管兩者在維持機體正常的生理功能中扮演著重要角色,但由于缺乏結(jié)構(gòu)信息,開發(fā)靶向這兩個受體的藥物仍面臨很大的挑戰(zhàn)。本論文期望通過解析激活狀態(tài)下的甲狀旁腺激素受體與配體、Gs蛋白形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu),闡明三者間相互作用的機制,為靶向藥物開發(fā)提供指導(dǎo)。PTH1R復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析與藥物作用位點研究中,我們對受體克隆、融合標(biāo)簽和表達(dá)系統(tǒng)進行了篩選,然后將Gs蛋白單獨純化并在受體純化時外源加入Gs蛋白獲得了復(fù)合物,但該復(fù)合物不穩(wěn)定無法進行冷凍電鏡收樣。后來我們嘗試將受體與Gs蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞中共表達(dá),然后加入長效激活甲狀旁腺激素(Long-acting PTH,LA-PTH)進行純化。共表達(dá)的蛋白可形成穩(wěn)定的復(fù)合物,在冷凍電鏡收樣和數(shù)據(jù)處理分析后,我們獲得了分辨率為3?的處于激活狀態(tài)的LA-PTH-PTH1R-Gs復(fù)合物。該結(jié)構(gòu)是首個配體-PTH1R-G蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu),為研究配體與受體和受體與G蛋白間的相互作用機制提供了詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息,也為基于PTH1R結(jié)構(gòu)的藥物研發(fā)創(chuàng)造了新的機遇。在PTH2R的結(jié)構(gòu)解析與藥物作用位點研究中,我們通過篩選不同融合標(biāo)簽、受體C端截短和W突變等獲得了穩(wěn)定表達(dá)的受體蛋白。將受體與Gs蛋白共表達(dá),并外源加入配體進行復(fù)合物純化。目前,我們已經(jīng)可以拿到配體-受體-Gs蛋白三聚體復(fù)合物,但該復(fù)合物還不夠穩(wěn)定,需要進一步優(yōu)化。雖然配體-PTH2R-Gs蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)目前還未得到解析,但前期的篩選優(yōu)化為后續(xù)的結(jié)構(gòu)解析提供了基礎(chǔ),也可為其他GPCRs的表達(dá)純化提供參考。除了對甲狀旁腺激素受體的結(jié)構(gòu)研究以外,本論文還包括對甲硫氨酰tRNA合成酶(Methionyl-tRNA synthetase,MRS)抑制劑的高通量篩選(High throughput screening,HTS)實驗。該實驗中我們建立了以Nano-BiT為基礎(chǔ)的篩選模型,然后對國家化合物樣品庫中96000個隨機選取的小分子化合物進行篩選。經(jīng)過初篩、復(fù)篩、特異性實驗、毒性實驗和細(xì)胞增殖實驗,我們最終篩選出兩個IC_(50)在幾十μM、毒性較小,且在細(xì)胞增殖實驗中表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖抑制作用的化合物WNN1588-A010和WNN1588-B003,為后期的功能研究和藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院上海藥物研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R91
【圖文】：

圖 1.1 經(jīng)典的 G 蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路示意圖re1.1 Classic G protein signal transduction pathway schematic diagramPCRs GPCRs 概況PCRs 對機體激素平衡起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，是一類非常重要的其的藥物可用于治療糖尿病、肥胖、精神疾病和骨疾等[25]。其成員（Calcitoninreceptor，CTR）和甲狀旁腺激素受體（ParathyroidhorTHR）可調(diào)控骨更新和鈣平衡，靶向這兩者的藥物可用于骨質(zhì)疏胰島素釋放和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的胰高血糖素樣受體 1（GlucagoGLP-1） 和葡萄糖依賴的促胰島素釋放肽（ Glucose-depe

圖 1.2 B 類 GPCR 各亞家族及其成員igure1.2 Class B GPCR subfamilies and members of each one GPCRs 由降鈣素受體家族、胰高血糖素受體家族、血管活性聚上腺皮質(zhì)釋放因子受體家族和甲狀旁腺激素受體家族五個亞庫 GPCR database 下載（https://gpcrdb.org/structure/statistics）。lass B GPCRs include five subfamilies which are calcitonin peptidticotropin-releasing factor receptors, glucagon receptors, vasoactivnd parathyroid hormone receptors.

hCTR-sCT-Gs[33]rGLP-1R-GLP1-Gs[37]hGLP-1R-ExP5-Gs[35]RAMP1-CLR-CGRP[36]圖 1.3 部分已解析的 GPCRs 全長結(jié)構(gòu)Figure1.3 Part of resolved GPCRs full-length structuresB 類 GPCRs 的 ECD 序列保守度較低，只有形成 3 對二硫鍵的 6 個半胱氨酸和其他十個左右的保守氨基酸。這些氨基酸中有 4 個氨基酸（在 PTH1R 中編碼為 D113，W118，P132 和 W154）是完全保守的。雖然 ECD 的序列保守性差，但所有的 B 類受體胞外區(qū)的基本結(jié)構(gòu)都是一個由三個層間二硫鍵固定的三層的α-β-β-α 折疊，且多肽激活都遵循“雙域模型”。[38]ECD 對于多肽配體與受體結(jié)合的高親和性和特異性是必不可少的，目前被解析的 ECD 結(jié)構(gòu)大部分是與配體結(jié)合的復(fù)合物，這表明配體的結(jié)合可以穩(wěn)定受體的 ECD[29, 30, 38]。TMD 的主要功能是通過構(gòu)像改變介導(dǎo)受體激活，同時向 G 蛋白傳導(dǎo)信號。

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本文編號：2787355