【摘要】：目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是嗜肝性DNA病毒,HBV感染可引起急性或慢性的病毒性肝炎,從而可發(fā)生肝臟的纖維化、肝硬化甚至是肝細(xì)胞癌癥。目前臨床上廣泛應(yīng)用的抗HBV的藥物主要有免疫調(diào)節(jié)劑和核苷類似物。抑制病毒是目前治療慢性乙型肝炎的重要手段,其中占首位的藥物有干擾素類和核苷(酸)類似物(NAs)。干擾素可以通過抗病毒、免疫調(diào)控的機理治療慢性肝炎(CHB)。它具有持續(xù)反應(yīng)率高、療效穩(wěn)定、治療過程相對穩(wěn)定、無耐藥性等優(yōu)點。但是干擾素治療效果很一般,初期常伴有一定時期的流感樣癥狀,能引發(fā)骨髓抑制、肝臟損害等不良反應(yīng),對于肝功能近于失代償或已經(jīng)發(fā)生的患者會產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。另外干擾素使用不便,通常為皮下注射,且對于免疫功能不全的患者不適用。因此,干擾素的臨床應(yīng)用受到很大限制。核苷類似物口服給藥方便生物利用度高、抗病毒作用較強,不依賴患者對HBV的免疫反應(yīng),故而不良反應(yīng)少而比較輕,可用于肝功能失代償者,因此在臨床上應(yīng)用廣泛,但核苷類似物不能徹底清除體內(nèi)病毒,需要持久應(yīng)用,容易發(fā)生耐藥性。本課題旨在研究10種中藥化合物體外抗乙肝病毒活性及其作用機制,為尋找新型抗乙肝病毒藥物奠定基礎(chǔ)。方法:本課題采用HepG2.2.15和HepGRL1細(xì)胞為模型選出10種化合物體外抑制HBV作用及對HBV X基因相關(guān)機制的初步探討,實驗分為兩部分,內(nèi)容如下:第一部分10種化合物抗HBV作用的體外篩選(1)藥物的細(xì)胞毒性檢測:HepG2.2.15和HepGRL1細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時后,加入所配不同濃度含藥培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)3天,第三天MTT法檢測化合物對于細(xì)胞的毒性。(2)藥物對HBV e抗原和s抗原抑制的檢測:HepG2.2.15和HepGRL1細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時后,加入所配不同濃度含藥培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)6天(每3天換液一次),收集6天的上清液,用ELISA方法檢測樣品對HBV s抗原和e抗原的表達(dá)量。(3)藥物對HBV病毒DNA抑制檢測:HepG2.2.15和HepGRL1細(xì)胞在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時后,加入所配不同濃度含藥培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)6天(每3天換液一次),收集上清液和細(xì)胞,用FQ-PCR法檢測化合物對細(xì)胞內(nèi)外HBV DNA的影響。第二部分10種化合物抗HBV X基因相關(guān)機制的初步研究RT-PCR法檢測化合物對HepG2.2.15細(xì)胞和HepGRL1細(xì)胞HBV X基因表達(dá)水平。HepG2.2.15和HepGRL1細(xì)胞在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時后,加入所配不同濃度含化合物的培養(yǎng)液,陽性對照組用3-TC和ETV,空白組只加入培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)6天(每3天換液一次),收集細(xì)胞提取RNA并反轉(zhuǎn),用RT-PCR法檢測化合物對細(xì)胞內(nèi)HBV X基因表達(dá)的影響。結(jié)果:第一部分10種化合物抗HBV作用的體外篩選(1)10種不同的化合物分別作用HepG2.2.15細(xì)胞和HepGRL1細(xì)胞,MTT法分別測出化合物對于兩種細(xì)胞的毒性計算出TC_(50)。(2)Elisa法檢測化合物對于兩種細(xì)胞的HBV e抗原和s抗原表達(dá)量的影響發(fā)現(xiàn),yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a、yxy1403b對HepG2.2.15細(xì)胞HBV e抗原和s抗原具有較強的抑制作用,另外yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a、yxy1403b對HepGRL1細(xì)胞的HBV e抗原具有較強的抑制作用。(3)用Q-PCR法檢測10種化合物對HepG2.2.15細(xì)胞和HepGRL1細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi)HBV DNA分泌的影響,發(fā)現(xiàn)yxy1741、yxy1483e、yxy1483c顯著性抑制HBV DNA復(fù)制,并且與空白組相比,抑制率超過50%,且該化合物顯著性抑制HBeAg、HBsAg水平。第二部分10種化合物抗HBV X基因相關(guān)機制的初步研究RT-PCR結(jié)果顯示yxy1483e不但對兩種細(xì)胞HBV e抗原和HBV s抗原和HBV DNA有一定抑制作用,而且能抑制細(xì)胞中HBV-X RNA的表達(dá)。結(jié)論:通過本研究表明,在HepG2.2.15細(xì)胞和HepGRL1細(xì)胞培養(yǎng)實驗中,yxy1483e能明顯抑制體外HBV DNA復(fù)制,同時能對HBsAg和HBeAg表達(dá)也有較強的抑制作用,且細(xì)胞毒性較小,對HBV-X RNA的表達(dá)有抑制作用,將有可能發(fā)展為新一種的抗HBV的藥物。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R965.1
【圖文】：

yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a和yxy1403b對野生型HBV細(xì)胞株HepG2.2.15作用6天的抑制的率

yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a和yxy1403b對拉米夫定耐藥HBV細(xì)胞株HepGRL1HBeAg的抑制作用（與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，與陽性對照組相比，□P<0.05，□□P<0.01）

幾種化合物對HBV細(xì)胞株Hep2.2.15HBV-X基因表達(dá)的影響

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 Shogo Ohkoshi;Haruka Hirono;Kazuhiko Watanabe;Katsuhiko Hasegawa;Masahiko Yano;;Contributions of transgenic mouse studies on the research of hepatitis B virus and hepatitis C virus-induced hepatocarcinogenesis[J];World Journal of Hepatology;2015年28期

2 Adam S Bodzin;Ronald W Busuttil;;Hepatocellular carcinoma: Advances in diagnosis, management, and long term outcome[J];World Journal of Hepatology;2015年09期

3 Koichi Honda;Masataka Seike;Shin-ichiro Maehara;Koichiro Tahara;Hideaki Anai;Akira Moriuchi;Toyokichi Muro;;Lamivudine treatment enabling right hepatectomy for hepatocellular carcinoma in decompensated cirrhosis[J];World Journal of Gastroenterology;2012年20期

4 王京麗;周超凡;;中草藥及其制劑對肝損傷的研究概述[J];中國中藥雜志;2011年23期

5 Masayuki Murata;Norihiro Furusyo;Mami Unno;Eiichi Ogawa;Kazuhiro Toyoda;Hiroaki Taniai;Hachiro Ohnishi;Jun Hayashi;;Long-term effects of lamivudine treatment in Japanese chronic hepatitis B patients[J];World Journal of Gastroenterology;2011年24期

6 楊芳;楊春;蘇建家;;乙型肝炎的預(yù)防和治療研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2011年04期

7 金宇;;慢性乙肝的非核苷類藥物治療初探[J];中國當(dāng)代醫(yī)藥;2011年06期

8 俞加勇;吳曉燕;朱方石;;中藥抗HBV的臨床研究進(jìn)展[J];東南國防醫(yī)藥;2010年01期

9 王選舉;黃正明;宋建國;;乙型肝炎病毒感染模型的研究進(jìn)展[J];傳染病信息;2009年03期

10 劉紅娥;周金鳳;;RNA干擾技術(shù)及其抗乙型肝炎病毒的相關(guān)研究[J];中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用;2009年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王娟;稀土雜多化合物抗乙型肝炎病毒的研究[D];吉林大學(xué);2014年

本文編號：2784552