【摘要】：研究背景與目的:前列腺癌是西方國家男性最常見惡性腫瘤,預(yù)計2019全球新發(fā)病例1,276,106例,死亡病例358,989例。初診前列腺癌病人中,僅約6%有轉(zhuǎn)移病灶,但死于前列腺癌病人中90%有骨轉(zhuǎn)移灶。近年來,隨著我國人口老齡化和生活方式的改變,前列腺癌的發(fā)病率明顯上升,與西方國家不同,我國前列腺癌患者中晚期比例更高,因此預(yù)后更差。前列腺癌是由雄激素信號通路推動,抗雄治療能抑制血清睪酮水平,在抗雄治療開始早期,前列腺癌能控制良好。但抗雄治療并非治愈性治療,幾乎所有病人會出現(xiàn)疾病進展�？剐壑委熯^程中,睪酮處于去勢水平,此時前列腺癌進展被稱為去勢抵抗性前列腺癌。在很長的一段時間,轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌的一線治療方案均為多西他賽。近年來,隨著新一代抗雄藥物如阿比特龍和恩雜魯胺等的出現(xiàn),多西他賽耐藥病人均采用新一代抗雄藥物治療并能有效延長病人生存期。最近,新一代抗雄藥物也被用于化療前轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌病人的治療并取得良好效果。臨床研究發(fā)現(xiàn),新一代抗雄藥物阿比特龍治療后產(chǎn)生耐藥的病人也會對多西他賽產(chǎn)生耐藥。盡管多西他賽和新一代抗雄藥物能有效改善去勢抵抗性前列腺癌患者的無進展及總體生存期,但整體而言對患者的預(yù)后改善仍十分有限,經(jīng)過一段時間的治療后,最終會進展為對兩類藥物均耐藥的去勢抵抗性前列腺癌。課題組前期合成一組HMCD染料,該類染料具有能使腫瘤顯像并富集于腫瘤的特性,后來,將該HMCD分子命名為DZ-1并以DZ-1為基礎(chǔ)合成一系列共軛化合物如DZ-gemcitabine、DZ-Cisplatin和DZ-SIM藥物等,DZ-SIM抑制前列腺癌細胞生長作用最強。DZ-SIM是以辛伐他汀(Simvastatin,SIM)與七甲川菁(heptamethine carbocyanine)近紅外(near infrared,NIR)熒光染料為基礎(chǔ)合成的共軛化合物。本課題擬研究共軛化合物DZ-SIM的腫瘤靶向性并明確該化合物對腫瘤生長的抑制作用及其作用機制。第一部分共軛化合物DZ-SIM對耐二代抗雄藥物和化療藥物的去勢抵抗性前列腺癌細胞惡性生物學行為的抑制作用內(nèi)容與方法:(1)結(jié)晶紫法細胞增殖實驗檢測不同濃度DZ-SIM對各種前列腺癌細胞增殖的抑制作用;(2)克隆形成實驗檢測不同濃度DZ-SIM對去勢抵抗性前列腺癌細胞C4-2B以及恩雜魯胺耐藥去勢抵抗性前列腺癌細胞C4-2B MDVR、多西他賽耐藥去勢抵抗性前列腺癌細胞C4-2B TaxR存活能力的影響;(3)劃痕實驗和transwell小室穿梭實驗(有和無matrigel覆蓋小室膜)檢測不同濃度DZ-SIM對耐藥去勢抵抗性前列腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響;(4)皮下移植瘤模型:選取NOD-SCID小鼠,于小鼠雙側(cè)皮下注射CWR22RV1細胞,游標卡尺定期監(jiān)測小鼠皮下移植瘤生長情況,評估DZ-SIM對去勢抵抗性前列腺癌細胞腫瘤生長能力的影響。結(jié)果:(1)結(jié)晶紫細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)DZ-SIM對各類前列腺癌細胞增殖均有很強的抑制作用,DZ-SIM對耐藥去勢抵抗性前列腺癌細胞的抑制作用呈時間和濃度依賴性,而DZ-1和SIM對癌細胞抑制作用較弱;(2)克隆形成實驗提示DZ-SIM對耐藥去勢抵抗性前列腺癌細胞的生長有明顯的抑制作用,且DZ-SIM濃度越高,對癌細胞的抑制作用越明顯;(3)劃痕實驗和transwell小室穿梭實驗發(fā)現(xiàn)DZ-SIM明顯抑制耐藥去勢抵抗性前列腺癌細胞的遷移和侵襲,且DZ-SIM濃度越高,對癌細胞遷移和侵襲能力抑制越明顯;(4)皮下移植瘤模型可見DZ-SIM明顯抑制去勢抵抗性前列腺癌細胞的生長;。結(jié)論:DZ-SIM在體內(nèi)和體外均能顯著抑制耐新一代抗雄藥物和化療藥的去勢抵抗性前列腺癌的增殖,DZ-SIM有望作為新的靶向藥物在臨床用于對新一代抗雄藥物和化療藥耐藥的去勢抵抗性前列腺癌病人的治療。第二部分共軛化合物DZ-SIM對耐新一代抗雄藥物和化療藥物的去勢抵抗性前列腺癌細胞抗癌作用的機制研究內(nèi)容與方法:(1)Mitotracker檢測藥物亞細胞定位與線粒體關(guān)系;(2)流式細胞儀檢測線粒體膜電位;(3)Seahorse XFe 96分析儀計算C4-2B細胞、C4-2B MDVR細胞和C4-2B TaxR細胞最佳FCCP濃度后使用Seahorse XFe 24分析儀使用細胞線粒體壓力測試試劑盒明確DZ-SIM對耐新一代抗雄藥物和化療藥物的去勢抵抗性前列腺癌的基礎(chǔ)耗氧率(Oxygen consumption rate,OCR)的影響;(4)轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學分析尋找DZ-SIM抑制耐藥去勢抵抗性前列腺癌細胞的共同作用靶點并用qRT-PCR驗證測序結(jié)果。結(jié)果:(1)Mitotracker檢測拍照與DZ-SIM圖像融合提示在C4-2B MDVR和C4-2B TaxR細胞中,DZ-SIM均定位于線粒體起作用;(2)DZ-SIM降低C4-2B MDVR和C4-2B TaxR細胞線粒體膜電位;(3)C4-2B細胞、C4-2B MDVR細胞和C4-2B TaxR細胞最佳FCCP濃度分別為0.5μM、0.25μM和1μM。與C4-2B細胞相比,耐藥細胞C4-2B MDVR和C4-2B TaxR的OCR和ECAR均明顯升高,DZ-SIM處理后能明顯降低C4-2B MDVR和C4-2B TaxR細胞OCR;(4)轉(zhuǎn)錄組測序后行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)在耐藥去勢抵抗性前列腺癌細胞中有72個共同表達升高的基因,DZ-SIM處后共同降低的有四個基因(CAMK2N1、HMGCS2、NR2F1和CDH3),qRT-PCR進一步驗證發(fā)現(xiàn),耐藥細胞中四個基因表達量升高,DZ-SIM處理后表達量明顯降低。結(jié)論:DZ-SIM定位于線粒體并降低耐藥去勢抵抗性前列腺癌細胞線粒體膜電位,DZSIM主要通過影響癌細胞線粒體代謝起作用,CAMK2N1、HMGCS2、NR2F1和CDH3是DZ-SIM在耐藥去勢抵抗性前列腺癌細胞中的潛在作用靶點。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96
【圖文】：

經(jīng)過不斷改進合成方式，增加了 DZ-1 的穩(wěn)定性和水溶性[1, 14, 15]，結(jié)構(gòu)式如圖1-1-A，辛伐他汀結(jié)構(gòu)式如圖 1-1-B，LelandW.K.Chung 教授實驗室（本實驗室）通過酰胺鍵將二者耦合而成，結(jié)構(gòu)式如圖 1-1-C，共軛化合物 DZ-SIM 分子量為 1180.04，最終將該共軛化合物命名為 DZ-SIM。圖 1-1-A 七甲川菁（heptamethine carbocyanine）近紅外（near infrared，NIR）熒光染料 DZ-1 的分子式

圖 1-1-B 辛伐他�。⊿imvastatin）的分子式 1-1-C 新型共軛化合物 DZ-SIM 的分子式，分子量=11DZ-SIM 體外實驗中能快速有效殺傷前列腺1 和 Simvastatin 對前列腺癌細胞影響較小。1 是常用的去勢抵抗性前列腺癌細胞，我們選其進行 DZ-SIM 對 CWR22RV1 細胞增殖的抑制作用，統(tǒng)計分

圖 1-1-C 新型共軛化合物 DZ-SIM 的分子式，分子量=1180.04。（二）DZ-SIM 體外實驗中能快速有效殺傷前列腺癌細胞，其原型藥 DZ-1 和 Simvastatin 對前列腺癌細胞影響較小。CWR22RV1 是常用的去勢抵抗性前列腺癌細胞，我們選其進行初步研究，采用結(jié)晶紫法檢測 DZ-SIM 對 CWR22RV1 細胞增殖的抑制作用，統(tǒng)計分析并計算半抑制濃度（halfmaximalinhibitoryconcentration,IC50）。濃度最高孔為 50μM，各孔倍比稀釋，梯度設(shè)置為 0,0.39, 0.78,1.56,3.125,6.25,12.5,25,50μM，如圖 1-2 所示。藥物作用 24 小時后，結(jié)晶紫法檢測細胞增殖。統(tǒng)計分析示 DZ-1 和 Simvastatin 在 CWR22RV細胞中的 IC50>50μM，而 DZ-SIM 對前列腺癌 CWR22RV1 的 IC50 為 4.2μM（圖 12），由此可知，對去勢抵抗性前列腺癌細胞起殺傷作用的主要是新型共軛化合物 DZSIM。

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1 馬建宏;曹開源;徐霖;鐘慧玲;張素粉;羅虹嬌;庹玖玲;張?zhí)?劉建中;;前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選[J];熱帶醫(yī)學雜志;2015年11期

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本文編號：2784185