【摘要】：細菌耐藥已成為危害全球公共衛(wèi)生的嚴重問題。近年來全球抗生素的使用量不斷增加,細菌耐藥的發(fā)生與傳播越來越嚴重,目前幾乎所有的病原菌均呈現(xiàn)出抗生素耐藥性,給全球醫(yī)療體系帶來巨大的經濟和社會負擔。不幸的是,新型抗生素的開發(fā)遠遠趕不上耐藥菌增長的速度,且隨著抗生素使用量的大幅增加,出現(xiàn)細菌耐藥性的時間也更為短暫�？咕氖情_發(fā)新型抗生素的重要候選者。它們由宿主表達以消除入侵的病原體并增強免疫應答。其中人中性粒細胞蛋白(human neutrophil protein-1,HNP-1)是人中性粒細胞的主要抗菌肽分子,主要存在于人中性粒細胞的溶酶體顆粒內,是迄今發(fā)現(xiàn)含量最多的殺菌分子。HNP-1具有廣泛的抗菌譜和極強的抗菌活性,對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌以及腺病毒、流感病毒、艾滋病毒等均有很強的殺傷活性,有可能成為新一代抗菌藥物,有助于解決細菌的耐藥性和抗生素的毒副作用等問題。盡管HNP-1有廣闊的應用前景,天然獲取HNP-1的量極其有限,而化學合成HNP-1則由于其分子內含有3對二硫鍵,難以保證多肽折疊時正確配對,從而影響其生物活性。因此,研究者嘗試通過各種融合表達策略進行基因工程表達,但是效果仍然不理想,很難使HNP-1形成正確的折疊。本課題研究HNP-1在大腸桿菌中有效表達、成熟過程及其殺菌機制,研究內容和結論主要包括以下三個方面:1.在大腸桿菌BL21(DE3)表達全長HNP-1過程中,會激活產生有殺菌活性的mature HNP-1:(1)用tricine gel體系比較IPTG誘導前、后蛋白表達的差異,發(fā)現(xiàn)誘導后蛋白樣品在3.4kD附近出現(xiàn)明顯的條帶,切膠質譜鑒定為mature HNP-1的肽段,并用top-down MS進一步確認了 mature HNP-1生成;(2)隨著IPTG誘導時間的延長,mature HNP-1表達量逐漸升高,而對應的活細菌數目卻顯著減少;(3)根據mature HNP-1分子量較小的特點,采用3kD超濾管對誘導后的全蛋白溶液進行超濾,得到純化的mature HNP-1蛋白;(4)分別用純化的preproHNP-1和matureHNP-1加入菌液中檢測生長曲線,顯示preproHNP-1沒有抑菌活性,而mature HNP-1具有抑菌作用。2.HNP-1能夠誘發(fā)大腸桿菌BL21(DE3)產生細菌程序性死亡:(1)采用非標定量蛋白質組學技術鑒定HNP-1參與抑菌過程的蛋白,根據誘導前、后差異蛋白的功能聚類,并結合文獻報道推測HNP-1誘發(fā)了細菌程序性死亡過程;(2)TUNEL染色顯示HNP-1促進DNA斷裂;Annexin V染色顯示HNP-1誘導使膜結構發(fā)生了顯著變化,主要是內膜外翻;掃描電鏡結果顯示細菌表面產生了大量凋亡樣小泡。上述經典表型實驗確認HNP-1誘發(fā)大腸桿菌細菌程序性死亡過程。3.HNP-1通過和RecA結合,抑制其活性:(1)采用Ni-NTAbeads富集帶有His-tag的HNP-1及其相互作用蛋白,經質譜鑒定,結合蛋白功能注釋,篩選得到可能和HNP-1相互作用的蛋白RecA;(2)Western blot驗證在HNP-1富集的相互作用蛋白溶液中存在RecA表達;又用RecA蛋白抗體富集其相互作用蛋白,在其中同樣鑒定到HNP-1,從而正向和反向都確認了兩者具有相互作用;(3)隨著誘導時間延長,mature HNP-1逐漸替代了 preproHNP1和RecA結合,進一步說明是mature HNP-1和RecA相互結合為主;(4)通過分子對接軟件ZDOCK和PyMoL預測RecA和mature HNP-1的結合位點,發(fā)現(xiàn)mature HNP-1正好能結合在RecA發(fā)揮重組修復活性的位點Asp-161和Ser-162,使RecA不能和DNA結合,抑制其活性;(5)采用體外實驗證實加入10 μM mature HNP-1可以顯著降低RecA和ssDNA的結合水平,抑制RecA酶活性。通過本項研究,我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌不能高效表達全長HNP-1的原因是會激活產生有殺菌活性的mature HNP-1。并通過超濾法獲得了純化的有活性的mature HNP-1,為批量生產mature HNP-1提供了一種操作簡單和成本低廉的技術方案。我們的研究還揭示了 mature HNP-1在細菌內的作用靶點RecA。Mature HNP-1可以抑制RecA蛋白和ssDNA結合,從而抑制其SOS修復功能。RecA由于其具有的重要功能,已經成為抗耐藥菌治療的理想靶點。鑒于HNP-1在抑制RecA活性中的重要作用,有望成為新型抗耐藥菌藥物。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R91
【圖文】：

新型抗生素的開發(fā)遠遠趕不上耐藥菌增長的規(guī)模（圖丨－３）。且隨著抗生素使逡逑用量的大幅增加，目前幾乎所有的抗生素都出現(xiàn)了抗性，人類面臨缺乏可用抗生逡逑素的困境（圖１－４）。逡逑＿一－一…’一逡逑７０－邋－二邐＿邋ＭＲＳＡ逡逑３０邋Ｈ邋Ｗ逡逑圖１－３抗生素耐藥性增加而新增抗生素數量下降［７］，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌逡逑（ＭＲＳＡ）、耐萬古霉素腸球菌（ＶＲＥ）、耐氟喹諾酮銅綠假單胞菌（ＦＱＲＰ）逡逑

邐２０１５邐－ｍｃｏｍｅ邋ｍｋｊｄｌｅ－ｉｎｃｏｍｅ逡逑圖１－２全球抗生素消費２０００－２０１５，邋（Ａ）中低收入國家抗生素消費量增速更快；（Ｂ）在中逡逑低收入國家中的人口大國的抗生素使用總量增長迅速［５］。逡逑Ｊ逡逑２０１７年世界衛(wèi)生組織公布了首份抗生素耐藥“重點病原體”清單［６］。該清單逡逑特別強調了對多種抗生素耐藥的革蘭氏陰性菌的威脅。這些細菌具有尋找新方法逡逑抵抗抗生素治療的內在能力，并且還可以廣泛傳播使其它細菌產生耐藥的遺傳物逡逑質。該清單根據新型抗生素的迫切需求程度將１２種耐藥菌分為三個類別：極為逡逑重要、十分重要和中等重要。極為重要組中包括包括碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不逡逑動桿菌、碳青霉烯類藥物耐藥綠膿桿菌和碳青霉烯類藥物耐藥、產超廣譜Ｐ－內酰逡逑胺酶腸桿菌科，這些細菌可引起嚴重且致命的肺部和血液感染。逡逑日益增加的耐藥菌數量給全球醫(yī)療體系帶來巨大的經濟和社會負擔。不幸的逡逑是，新型抗生素的開發(fā)遠遠趕不上耐藥菌增長的規(guī)模（圖丨－３）。且隨著抗生素使逡逑用量的大幅增加，目前幾乎所有的抗生素都出現(xiàn)了抗性，人類面臨缺乏可用抗生逡逑素的困境（圖１－４）。逡逑＿一－一…’一逡逑７０－邋－二邐＿邋ＭＲＳＡ逡逑３０邋Ｈ邋Ｗ逡逑圖１－３抗生素耐藥性增加而新增抗生素數量下降［７］，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌逡逑（ＭＲＳＡ）、耐萬古霉素腸球菌（ＶＲＥ）、耐氟喹諾酮銅綠假單胞菌（ＦＱＲＰ）逡逑

圖１４耐藥菌和所對應的抗生素ｒａ逡逑耐藥菌使新型抗生素研發(fā)受阻邐‘逡逑圖１－４所示，制藥企業(yè)和科研機構對新型抗生素研發(fā)投入持續(xù)降低，藥菌的出現(xiàn)使藥物利潤大幅減少。在開始加入致死劑量的抗生素能迅分對抗生素敏感的細菌群體，但是菌群中仍然存在少量以非常慢的速生長的殘留細胞，稱為持留菌（ｐｅｒｓｉｓｔｅｒ），是形成抗生素耐藥菌的關Ｉ邐ＩＩ邐１１１邐ＩＶ逡逑丨—ｓｎｓ邋＝＝邋0ｉｓ＾ｒ0ｍ逡逑Ｉ逡逑，邐ＩＶ邐ＩＶ逡逑

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本文編號：2780462