【摘要】：褐藻寡糖是褐藻膠的降解產(chǎn)物,由甘露糖醛酸(M)和古洛糖醛酸(G)構(gòu)成,是一種陰離子寡糖,具有諸多生理藥理學活性。通過生物降解法獲得褐藻寡糖具有快速高效,反應溫和等諸多優(yōu)點,得到的褐藻寡糖為不飽和寡糖,具有諸多飽和寡糖不具備的生物活性。但生物降解法獲得的褐藻寡糖是聚合度不一的寡糖混合物,糖基組成和寡糖活性存在較大差異,嚴重影響了批次穩(wěn)定性及產(chǎn)品品質(zhì),限制了其推廣應用。為此,本論文使用Isoptericola halotolerans CGMCC 5336褐藻膠裂解酶制備褐藻寡糖,經(jīng)分離、純化后得到聚合度均一的寡糖,并對其純度、結(jié)構(gòu)進行分析。在此基礎上,研究了不同組分對HepG2細胞低密度脂蛋白受體(LDLR)和前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)表達水平的作用,確定了不同組分對脂蛋白代謝的影響,以期為后續(xù)應用奠定基礎。主要研究工作如下:(1)使用褐藻膠裂解酶制備褐藻寡糖,經(jīng)乙醇沉淀去除大分子多糖及蛋白質(zhì),命名為FrA。通過薄層色譜法(TLC)和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)對其組成進行初步分析。結(jié)果表明,FrA中寡糖的聚合度為2-6,其中二、三、四糖含量較高,五、六糖含量較低。通過RT-PCR和Western Blot技術(shù),研究了FrA對HepG2細胞中LDLR和PCSK9的基因和蛋白水平的影響,結(jié)果表明,1 mg/mL的FrA能夠上調(diào)LDLR的基因及蛋白水平。并且可以下調(diào)PCSK9的基因及蛋白水平。分別通過離子交換色譜法(DEAE)和凝膠色譜法(Bio Gel P2)對FrA進行分離,最終確定使用Bio Gel P2凝膠柱進行分離純化,共得到四個組分,分別命名為Fr1、Fr2、Fr3、Fr4。(2)通過TLC和LC-MS,對Fr1、Fr2、Fr3和Fr4進行分析;通過高效液相色譜法(HPLC)和核磁共振頻譜(NMR)對Fr2、Fr3和Fr4進一步分析。結(jié)果表明Fr1中含有兩種聚合度的寡糖,為五糖和六糖;Fr2、Fr3和Fr4均為聚合度均一的寡糖,分別為四糖、三糖和二糖。除Fr4外,其余兩種寡糖中均存在同分異構(gòu)體,Fr2中含有四種寡糖,Fr3中含有兩種寡糖。經(jīng)NMR分析,Fr2中寡糖為△MGG、△GGG、△GMG和△MMG;Fr3中寡糖為△GG和ΔMG;Fr4中寡糖為△G。所獲得的褐藻寡糖其還原端均為古洛糖醛酸殘基,說明所使用的褐藻膠裂解酶能夠特異性識別G(1→4)M或G(1→4)G片段。如果將G(1→4)視為0位,(1→4)(G/M)視為1位,則當酶解片段-1位為古洛糖醛酸時,該酶活是-1位為甘露糖醛酸殘基的寡糖片段的3倍。(3)對所獲得的四個組分進行活性評價。研究了其對LDLR的基因和蛋白水平的調(diào)節(jié)作用以及對PCSK9蛋白水平的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,四個組分中Fr1,Fr3,Fr4均能上調(diào)LDLR的蛋白水平,其中Fr3和Fr4的活性均較為顯著。Fr3能下調(diào)PCSK9的蛋白水平,故Fr3對LDLR蛋白表達水平的上調(diào)作用可能與PCSK9有關(guān)。而Fr4對LDLR的上調(diào)作用與PCSK9無關(guān),可能受到固醇反應原件結(jié)合蛋白-2(SREBP-2)的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明,Fr3和Fr4可能會上調(diào)LDLR增加對LDL-膽固醇的攝取,在降膽固醇方面具有潛在的應用價值。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R91
【圖文】：

第一章 緒論藻膠概述藻膠的結(jié)構(gòu)藻膠是一種由海洋褐藻生成的陰離子多糖[1]。是由（1→4）連接的 D-甘露和其 C5 異構(gòu)體 L-古洛糖醛酸（G）組成的線性聚合物，以均聚（MM 或 MG 或 GM）方式排列組成[2; 3]。主要存在三種結(jié)構(gòu)片段：β-D- (1，4)連接 酸 片 段 (Polymannuronate ， PM) ， -L-(1 ， 4) 連 接 的 聚 古 洛 糖 醛 uluronate，PG)，G 與 M 交替共聚的片段 PMG[4]。雖然 G 與 M 僅 C5 上的，但是聚合成鏈后空間結(jié)構(gòu)卻差異巨大。甘露糖醛酸之間通過 le-4e 兩個，其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出“帶”狀；而古洛糖 醛酸則是通過 1a-4a 兩個平伏鍵相連接現(xiàn)為“脊柱”狀[5]，如圖 1-1 所示。

20 左右的聚糖�；瘜W降解法具有生產(chǎn)成本低、技術(shù)成熟、反應機理明確環(huán)境污染較大。2）物理法。物理降解法通常用作其他方法的輔助方法，物理降解法常用聲等方法。其中，超聲波法的降解產(chǎn)物極限分子量為 50000 左右，不能獲的寡糖，故不常用于制備寡糖。Aida 等通過高溫降解法制備褐藻寡糖，但，生成得到的單糖易生成乳酸等有機酸[24]。相較于化學法，物理法具有操速、無環(huán)境污染等優(yōu)點。3）酶解法。酶作為高效的生物催化劑，在食品、醫(yī)藥等各個領(lǐng)域內(nèi)被廣法因其反應溫和、操作簡便，被廣泛應用于寡糖的制備。多糖裂解酶是降工具酶。例如，多糖水解酶用于降解中性多糖，多糖水解酶和裂解酶可降[25]。多糖裂解酶用于降低多糖的分子量生成具有不同聚合度的寡糖，其聚 到 5，并且聚合度不同的寡糖具有不同的生物活性[26-28]。褐藻膠裂解酶通藻膠中的（1→4）糖苷鍵斷裂而制備寡糖。生成寡糖在非還原端的 C4，鍵，如圖 1-2。所生成的不飽和低聚寡糖在紫外區(qū)域 230 nm-240 nm 處有; 30]。同時，生成的不飽和寡糖具有與飽和寡糖不同的生理活性。

圖 1-3 凝膠層析原理Fig.1-3 Principle of gel chromatography丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，用于高分辨率的凝膠過濾。是以丙烯甲叉雙丙烯酰胺膠聯(lián)而成，后經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成顆粒。通過控制來制備各種型號的凝膠，交聯(lián)劑越多，孔隙越小，所能分離的物質(zhì)的分子與分離范圍如表 1-1 所示。表 1-1 主要型號及分離范圍Table 1-1 Main model and separation range型號 分離范圍（Da）Bio-Gel P 2 100 1,800Bio-Gel P 4 800 4,000Bio-Gel P 6 1,000 6,000Bio-Gel P 10 1,500 20,000Bio-Gel P 30 2,400 40,000Bio-Gel P 60 3,000 60,000

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本文編號：2770805