【摘要】：山豆根是最初記載于《開寶本草》的一種中藥,前期對(duì)山豆根的研究發(fā)現(xiàn)其中含有Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,而該類型化合物具有一定的抗腫瘤活性。但是Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物在山豆根中的含量較低,且提取收率低,所以如何大量得到該類型化合物已成為當(dāng)務(wù)之急。本課題對(duì)Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物的仿生合成方法進(jìn)行研究,為該類型化合物的深入研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ),后續(xù)對(duì)該類型化合物的抑制腫瘤活性和選擇性進(jìn)行評(píng)價(jià),并對(duì)其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行研究,期望發(fā)現(xiàn)新的前體化合物或候選藥物。目的和意義:通過(guò)前期工作,我們發(fā)現(xiàn)Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用,研究采用仿生合成的方法來(lái)構(gòu)建合成路線短、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、收率高的合成工藝,并通過(guò)體外活性測(cè)定方法來(lái)評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性,進(jìn)而對(duì)其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行深入研究。研究方法:首先對(duì)Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物進(jìn)行仿生合成,并對(duì)合成工藝條件進(jìn)行優(yōu)化;通過(guò)MTT法測(cè)定Tonkinensine B對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制活性,計(jì)算其IC_(50),確定Tonkinensine B的有效濃度;使用Hoechst33342染色法觀察Tonkinensine B引起MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化;通過(guò)細(xì)胞流式技術(shù)研究Tonkinensine B促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的作用;使用Western Blot測(cè)定MDA-MB-231細(xì)胞的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑中Bcl-2、Bax、Cytochrome C蛋白的表達(dá)量,從而確定Tonkinensine B對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。研究成果:本實(shí)驗(yàn)以N,N-4-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)為催化劑,以(-)-Cytisine和(-)-Maackiain為底物,在HCHO的存在下以溫和方式合成了Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,并通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件,構(gòu)建了較優(yōu)的合成工藝。對(duì)(-)-Cytisine、(-)-Maackiain和Tonkinensine B進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)定,測(cè)定的細(xì)胞株包括MCF-7、MDA-MB-231、3LL、9L、Raw264.7、BV2,研究發(fā)現(xiàn)Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用,尤其是對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的毒性較明顯(IC_(50)=19.2μM)。Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物對(duì)正常的免疫細(xì)胞Raw264.7和BV2細(xì)胞的毒性數(shù)據(jù)表明該類化合物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有低的細(xì)胞毒副作用;細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡是發(fā)生在細(xì)胞凋亡的晚期;Western Blot實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明該類化合物可調(diào)控MDA-MB-231細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cytochrome C蛋白的表達(dá)。所得結(jié)論:我們用仿生合成的方法將(-)-Cytisine和(-)-Maackiain偶聯(lián)合成Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,該類化合物能夠有效地降低三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的活性,加速細(xì)胞的凋亡,并且細(xì)胞凋亡是通過(guò)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑,其具體機(jī)制是通過(guò)上調(diào)Bax/Bcl-2蛋白的比值,促進(jìn)Cytochrome C從線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放,最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。學(xué)術(shù)意義與應(yīng)用前景:乳腺癌是當(dāng)今臨床上常見(jiàn)的一種惡性腫瘤,據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率已經(jīng)成為女性腫瘤的首位。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和細(xì)胞分子生物學(xué)的快速發(fā)展,人們對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡通路中信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有了深入了解,人體通過(guò)細(xì)胞凋亡這一生理過(guò)程能夠有效的抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),因此惡性腫瘤的治療方法主要是以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡來(lái)遏制腫瘤的生長(zhǎng)。本課題通過(guò)采用仿生合成的方法得到Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,對(duì)其抗腫瘤生物活性進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)其對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231具有較為明顯的毒性作用,我們應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)手段,考察Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,探討其促進(jìn)MDA-MB-21細(xì)胞凋亡通路的分子機(jī)制,未來(lái)有利于闡明乳腺癌的具體發(fā)病機(jī)制,為開發(fā)新的乳腺癌治療藥物提供更多的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R914;R96
【圖文】：

23]，進(jìn)一步表明金雀花堿在化學(xué)合成以及藥物研發(fā)方面的重要性。圖1-1 (-)-Cytisine的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1-1. Structures of (-)-Cytisine1.1.3 Pterocarpan 的概述Pterocarpan 屬于異黃酮類化合物，中文名叫“紫檀素”，從 1874 年第一個(gè)紫檀素類化合物被分離得到以后，其一直是研究的熱點(diǎn)。(-)-Maackiain 屬于異黃酮類化合物，中文名字為“高麗槐素”，又名馬卡因，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖 1-2。高麗槐素廣泛存在于紅車軸草[25]、牛大力、錦雞兒[26]等植物中，其中紅車軸草是一種全國(guó)范圍內(nèi)廣泛分布的天然植物，多分布在草原或綠洲地區(qū)，尤其在新疆地區(qū)最為常見(jiàn)。通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)的收集整理發(fā)現(xiàn)，高麗槐素能夠有效地抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和谷草芽孢桿菌的分裂生長(zhǎng)，具有很好的抗真菌和抗細(xì)菌功效[27]

進(jìn)一步表明紫檀類化合物在藥物研發(fā)方面的重要性。圖1-2 (-)-Maackiain的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1-2. Structures of (-)-Maackiain1.1.4 Cytisine-Pterocarpan 新骨架化合物的概述(-)-Cytisine 和 Pterocarpan 這兩種類型的化合物在藥物研發(fā)領(lǐng)域一直為研究者所關(guān)注，但是具有 Cytisine-Pterocarpan 偶聯(lián)骨架的化合物還是首次被發(fā)現(xiàn)[38]。其中 具 有 Cytisine-Pterocarpan 新 骨 架 化 合物 的 兩 個(gè) 化 合 物 Tonkinensine A 和Tonkinensine B 是山豆根中含量較低的化合物，前期對(duì)它們的抗腫瘤活性進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn) Tonkinensine B 對(duì)人類宮頸癌 HeLa 細(xì)胞和人三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞具有一定的生長(zhǎng)抑制作用，所以有必要對(duì)具有該新骨架類型化合物的發(fā)現(xiàn)、合成以及生物活性進(jìn)行深入的研究。圖1-3 Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1-3. Structures of Cytisine-Pterocarpan derived compounds1.2 研究目的隨著對(duì)中藥成分的活性篩選、細(xì)胞分子生物學(xué)等技術(shù)的不斷深入研究，從自然界常見(jiàn)的植物中研究開發(fā)出高效低毒的腫瘤治療藥物或先導(dǎo)化合物已經(jīng)成為開展新型抗癌藥物的一個(gè)重要的途徑。自然界中存在的植物種類多樣，來(lái)源不同的植物其所含的成分也存在很大的差異，該性質(zhì)造成了不同天然植物中有效成分的千差萬(wàn)別

圖1-2 (-)-Maackiain的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1-2. Structures of (-)-Maackiain1.1.4 Cytisine-Pterocarpan 新骨架化合物的概述(-)-Cytisine 和 Pterocarpan 這兩種類型的化合物在藥物研發(fā)領(lǐng)域一直為研究者所關(guān)注，但是具有 Cytisine-Pterocarpan 偶聯(lián)骨架的化合物還是首次被發(fā)現(xiàn)[38]。其中 具 有 Cytisine-Pterocarpan 新 骨 架 化 合物 的 兩 個(gè) 化 合 物 Tonkinensine A 和Tonkinensine B 是山豆根中含量較低的化合物，前期對(duì)它們的抗腫瘤活性進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn) Tonkinensine B 對(duì)人類宮頸癌 HeLa 細(xì)胞和人三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞具有一定的生長(zhǎng)抑制作用，所以有必要對(duì)具有該新骨架類型化合物的發(fā)現(xiàn)、合成以及生物活性進(jìn)行深入的研究。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2762397