【摘要】：輔酶原位再生系統(tǒng)是指在依賴輔酶的反應系統(tǒng)內(nèi)部,用催化氧化/還原的方法實現(xiàn)輔酶在氧化態(tài)與還原態(tài)之間的循環(huán)。這種催化輔酶再生的方法可以大幅減少工業(yè)生產(chǎn)中輔酶的投入量,減少生產(chǎn)成本。本研究利用偶聯(lián)醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶構建NADH再生系統(tǒng),將該系統(tǒng)應用于藥物中間體(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯[(S)-CHBE]的合成。利用偶聯(lián)阿拉伯糖醇脫氫酶和NADH氧化酶構建NAD~+再生系統(tǒng),并應用于稀有糖L-木酮糖的合成,具體研究內(nèi)容如下:(1)表達載體的構建和轉化:從菌株Bartonella apis,Bacillus sp.ZJ和Aspergillus nidulans中抽提基因組DNA,通過PCR技術克隆出目的基因,根據(jù)來源物種名稱,將醇脫氫酶,葡萄糖脫氫酶和阿拉伯糖醇脫氫酶分別命名為BaADH,BsGDH和ArDH。將目的基因連接到表達質(zhì)粒pET-28a(+)上,并將重組質(zhì)粒轉化到表達宿主E.coli BL21中。(2)酶的表達和性質(zhì)表征:BaADH和ArDH的最適溫度分別為50℃和40℃,分別在pH為8.0和9.5的緩沖液中表現(xiàn)出最大活性;添加Mn~(2+)能明顯提高酶的活性。在30℃時,BaADH在保溫35 h后失去一半活性,而ArDH的活性半衰期為8.3 h。米氏常數(shù)測定的結果顯示,對于BaADH,V_(max)=190.4 U/mg,K_m=0.11mM;對于ArDH,V_(max)=9.1 U/mg,K_m=1.2 mM。(3)利用BaADH-BsGDH構建NADH輔酶再生體系,分別對反應溫度、pH、輔酶濃度和底物濃度進行優(yōu)化。結果表明,使用pH 7.0 Tris-HCl緩沖液,該催化系統(tǒng)在35℃反應8 h后,100 mM的COBE的轉化率達到94.9%,NADH濃度為0.5μM時,輔酶總轉化數(shù)(TTN)達到5940,可滿足工業(yè)應用的要求。(4)利用ArDH-Nox構建NAD~+輔酶再生體系,對系統(tǒng)的催化反應條件進行優(yōu)化。結果表明在pH 5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中30℃催化氧化20 mM阿拉伯糖醇,反應8 h的轉化率達到91.5%,NADH濃度為5μM時,最高TTN值為1020。本文建立了輔酶NAD(H)的酶偶聯(lián)再生系統(tǒng),利用該輔酶再生體系實現(xiàn)了藥物中間體和稀有糖的酶促生產(chǎn),體現(xiàn)輔酶再生系統(tǒng)在工業(yè)生產(chǎn)中的應用潛力。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914
【圖文】：

圖 1.1 偶聯(lián)酶再生輔酶示意圖.1 Cofactor regeneration by enzyme coupling 輔酶時，由于其只需要輔底物而不需要偶聯(lián)置，節(jié)省了偶聯(lián)酶表達和純化所需的生產(chǎn)成條件反應不一樣時，有必要優(yōu)化條件并找到H。底物偶聯(lián)法單酶催化的特點避免了主反制性影響，但底物偶聯(lián)法的局限性也是很明要該酶既能利用一種底物進行氧化還原的主再生的副反應（圖 1.2）。

圖 1.2 通過共底物再生輔酶示意圖 1.2 Cofactor regeneration by substrate coupling me關的酶進行再生的過程中，通常是引入例如甲酸脫氫酶氧化還原酶消耗 NADH 進行主反應的同時，偶聯(lián)第二底物進行氧化反應[21]。而關于氧化型輔酶 N氧化酶催化氧化 NADH 進行氧化型煙酰胺的再生置，操作簡單，適用范圍廣，以及廉價的額外底用的一種方法。另外，由于一些主反應的酶專一物來啟動酶的另一個反應，利用單個酶即可達到

種輔酶再生體系生產(chǎn)（A）(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯和（B糖Fig 1.3 Two coenzyme regeneration systems which produce (A(S)-4-chloro-3-hydroxybutyrate and (B) L-xylulose的主要研究內(nèi)容原酶的克隆表達基因挖掘，篩選含有醇脫氫酶，葡萄糖脫酶基因的菌株，抽提菌株的基因組 DNA，用設計的引物擴增，并連接到大腸桿菌表達質(zhì)粒上，構建重組表達宿主。 BaADH 和葡萄糖脫氫酶 BsGDH 的性質(zhì)表征，偶聯(lián)構建

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 李林波;羅宇;屈凌波;熊玉春;李鳳娟;;NADH氧化酶研究進展[J];河南工業(yè)大學學報(自然科學版);2010年04期

2 董志姚;李秀芬;劉立明;堵國成;陳堅;;過量表達NADH氧化酶加速光滑球擬酵母合成丙酮酸[J];微生物學報;2008年08期

本文編號：2755932