【摘要】：組蛋白去乙�；�(Histone deacetylase,HDACs)可催化水解底物ε-N-乙酰化賴氨酸殘基脫除乙酰基,其底物包括組蛋白或非組蛋白的底物。該酶在表觀遺傳調(diào)控和多種細(xì)胞的調(diào)節(jié)過程中起關(guān)鍵作用,特別是該酶在許多腫瘤組織中高表達(dá),HDACs成為癌癥治療領(lǐng)域的熱門靶標(biāo)。組蛋白去乙�；敢种苿�(histone deacetylase inhibitors,HDACi)可引起腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯和DNA損傷等作用,目前已有多個(gè)藥物上市。當(dāng)前在HDAC抑制劑的研發(fā)中,急需發(fā)展新型的高通量HDACs抑制劑篩選方法,以加快藥物發(fā)現(xiàn)的速度。隨著近十幾年的發(fā)展,毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis,CE)已成功應(yīng)用于多種藥物靶標(biāo)的活性篩選。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)包括測(cè)試模式多且效率高、分析時(shí)間短、酶和底物消耗量低以及能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化運(yùn)行。除了傳統(tǒng)的離線分析手段,該領(lǐng)域還發(fā)展了毛細(xì)管在線分析技術(shù),包括電泳調(diào)控微分析法和固定化酶微反應(yīng)器法。這兩種常見的毛細(xì)管在線分析手段已被廣泛應(yīng)用于酶學(xué)研究。電泳調(diào)控微分析法(Electrophoretical mediated microanalysis,EMMA)是在毛細(xì)管內(nèi),同時(shí)進(jìn)行酶促反應(yīng)以及其底物和產(chǎn)物分離測(cè)試的在線分析方法。該方法將酶和底物依次進(jìn)樣至毛細(xì)管前端,并以此作為酶促反應(yīng)發(fā)生場(chǎng)所。通過施加電壓,促使酶和底物在管內(nèi)充分混合反應(yīng);反應(yīng)結(jié)束后,施加分離電壓使產(chǎn)物和未反應(yīng)底物在毛細(xì)管內(nèi)分離并進(jìn)行測(cè)定。毛細(xì)管電泳固定化酶微反應(yīng)器(Capillary electrophoresis immobilized enzyme microreactor,CE-IMERs)是將毛細(xì)管電泳與固定化酶技術(shù)相結(jié)合的新型在線酶學(xué)測(cè)定方法。該方法通過一定的固定化方式將靶酶固定在毛細(xì)管的進(jìn)樣端,于是制備得到CE-IMERs,用于酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和酶抑制劑動(dòng)力學(xué)在線研究。該法的優(yōu)點(diǎn)在于試劑消耗量小、操作簡便、可實(shí)現(xiàn)靶酶的重復(fù)使用,是新型的酶抑制劑高通量篩選方法。我們應(yīng)用電泳調(diào)控微分析法,實(shí)現(xiàn)了 HDACs抑制劑的毛細(xì)管電泳在線篩選,為該類抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新的篩選模型。本文對(duì)分離條件、混合條件等方面進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)初步建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,證明該方法穩(wěn)定、高效、可重復(fù)。我們應(yīng)用所建方法測(cè)定了 HDACs的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和3種經(jīng)典HDACs抑制劑的表觀抑制常數(shù)。本文建立的EMMA方法測(cè)定結(jié)果與經(jīng)典熒光法及文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致,說明該法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。本文使用海藻酸鈣包埋法制作了 HDACs毛細(xì)管電泳固定化酶微反應(yīng)器,通過將含有HDACs的海藻酸鈉溶膠灌注于毛細(xì)管一端,施加電壓驅(qū)動(dòng)緩沖液中鈣離子通過溶膠區(qū)域與鈉離子置換,在毛細(xì)管端口形成海藻酸鈣凝膠,從而將HDACs包埋并固定在毛細(xì)管端口。經(jīng)條件優(yōu)化,初步建立的毛細(xì)管電泳固定化酶微反應(yīng)器穩(wěn)定性和批間重復(fù)性良好,所測(cè)定的HDACs酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果和HDACs抑制劑動(dòng)力學(xué)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。以上結(jié)果說明,本法制得的CE-IMERs具有測(cè)試簡單高效、節(jié)約反應(yīng)物料以及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn),未來可能成為組蛋白去乙�；敢种苿┭邪l(fā)的有力武器。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R91
【圖文】：

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文逡逑目前腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)話題之一，目前經(jīng)典的ＨＤＡＣｓ抑制劑的結(jié)構(gòu)分為逡逑部分：表面識(shí)別區(qū)、鉸鏈區(qū)和鋅離子螯合基團(tuán)（見圖Ｍ）邋＾抑制劑的類型逡逑鋅離子螯合基團(tuán)的不同分為可以為異羥肟酸類（如Ｍｅｒｃｋ公司研制的逡逑ｏｓｔａｔ和Ｔｓｕｊｉ發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ）、鄰苯二胺類（如Ｍｉｔｓｕｉ逡逑ｉｃａｌｓ公司開發(fā)的Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ和國產(chǎn)原研抗癌藥物西達(dá)本胺）和環(huán)肽類（如逡逑ｃｅｓｔｅｒ邋研發(fā)的邋Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ）。［２４，２５］逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋ＨＤ邋ＡＣ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｍａｒｋｅｔ逡逑１．２．２組蛋白去乙�；敢种苿┑淖饔脵C(jī)制逡逑現(xiàn)階段研宄表明，組蛋白去乙�；钢饕饔糜诎┊惓Ｒ阴；慕M蛋白上其去乙酰化，從而影響下游眾多信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤活性。其具體作用主要為以下幾個(gè)方面：逡逑表１－３組蛋白去乙酰化酶的作用機(jī)制逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－３邋Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ＨＤＡＣｉ逡逑功能表現(xiàn)邐作用機(jī)制逡逑阻滯腫瘤細(xì)胞的邐抑制細(xì)胞周期蛋ｄ和周期蛋ａ依賴性激酶的細(xì)胞周期邐腫瘤細(xì)胞停滯在Ｇ１或Ｇ２／Ｍ期逡逑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡邐胞外細(xì)胞凋亡通路：上調(diào)死亡受體及于其相關(guān)蛋

者的相互作用使含有放射性的乙酰基與閃爍劑靠近，激發(fā)ＳＰＡ珠閃爍，從而被逡逑閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)。而經(jīng)ＨＤＡＣｓ催化的脫乙�；牡孜镏校郏常龋菝撀�，從而使ＳＰＡ逡逑信號(hào)減少。通過測(cè)定ＳＰＡ信號(hào)的多少來反應(yīng)ＨＤＡＣｓ的活性。方法原理如圖１－３逡逑所示。此方法可在微孔板中直接測(cè)定ＳＰＡ的強(qiáng)度，無需提取分離步驟。逡逑１０逡逑

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10 陳W

本文編號(hào)：2754060