【摘要】：目的:腫瘤嚴重威脅人類生命健康,且發(fā)生率呈逐年上升趨勢。目前,大多數化療藥物屬于細胞毒類藥物,毒副作用大。因此,尋找安全有效的抗腫瘤藥物已成為科學家和臨床醫(yī)學工作者面臨的重大挑戰(zhàn)。恩再適(analgecine,AGC),系牛痘疫苗致炎兔的皮膚提取物,是在健康家兔皮膚內接種人用牛痘疫苗產生的小分子非蛋白活性物質。恩再適對神經損傷或由其他疾病引起的慢性疼痛、冷感、麻木等癥狀均有顯著療效,除此之外,恩再適還具有抑制或減輕炎癥反應、雙向調節(jié)機體免疫的作用,然而腫瘤的發(fā)展過程與炎癥反應及免疫功能低下都息息相關。因此,探討恩再適是否具有抗腫瘤作用,無疑具有重要的理論意義和潛在的應用價值。方法:(1)體外抑瘤活性檢測:復蘇培養(yǎng)Hep G2、LM3、He La、A549和H460五種人源腫瘤細胞,以不同濃度恩再適分別作用上述細胞24 h,使用CCK-8法檢測細胞增殖活性。(2)淋巴細胞因子分泌刺激實驗:無菌分離小鼠脾臟,制備并培養(yǎng)脾淋巴細胞,不同濃度恩再適作用于細胞24 h,收集上清,采用ELISA試劑盒檢測恩再適對其分泌細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-12的影響。(3)淋巴細胞刺激上清對腫瘤細胞的影響:采用恩再適刺激脾淋巴細胞,將其上清液以不同體積比分別與Hep G2細胞共培養(yǎng)24 h,使用CCK-8法檢測細胞增殖活性。(4)體內抑瘤活性:將皮下接種LM3成瘤的BALB/C裸鼠隨機分成5組,分別是空白對照組,陽性對照組,恩再適低、中、高劑量組�？瞻讓φ战M給予0.9%氯化鈉注射液,0.2 ml/d;陽性對照組給予環(huán)磷酰胺,20 mg/kg,隔天給藥一次;恩再適低、中、高劑量組,分別給予0.01 U/g/d、0.02 U/g/d和0.04 U/g/d。給藥方式均為腹腔注射,連續(xù)給藥15天,動態(tài)監(jiān)測腫瘤體積及體重。結束實驗時取出腫瘤組織和脾臟組織并進行稱重和測量,計算抑瘤率和脾臟指數。(5)聯合給藥體內抑瘤實驗:將皮下接種LM3成瘤的BALB/C裸鼠隨機分成5組,分別是對照組,恩再適組,環(huán)磷酰胺低、高劑量組,恩再適與環(huán)磷酰胺聯合給藥組。對照組給予0.9%氯化鈉注射液,0.2 ml/d;恩再適組,0.02 U/g/d;環(huán)磷酰胺低、高劑量組,分別給予10 mg/kg和20 mg/kg,隔兩天給一次藥;恩再適與環(huán)磷酰胺聯合給藥組,0.02 U/g+10 mg/kg,恩再適每天給一次藥,環(huán)磷酰胺隔兩天給一次藥。給藥方式均為腹腔注射,連續(xù)給藥15天。結束實驗時將腫瘤組織和脾臟組織取出并進行稱重和測量,計算抑瘤率和脾臟指數。結果:(1)恩再適對培養(yǎng)的腫瘤細胞具有一定的增殖抑制活性:隨恩再適濃度的增加,5種腫瘤細胞的抑制率逐漸增加,當恩再適濃度達到1.63 U/ml時,對Hep G2、LM3、H460、A549、He La細胞的抑制率分別為58.95%、55.08%、57.28%、45.80%、48.18%。(2)恩再適具有刺激淋巴細胞分泌細胞因子的作用:采用不同濃度恩再適作用脾淋巴細胞后,IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-12的分泌水平均有所提高。與對照組相比,恩再適0.163和0.815 U/ml組脾淋巴細胞IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌水平顯著提高(P0.01)。恩再適0.0815、0.163和0.815 U/ml組IL-12的分泌水平均顯著提高(P0.01)。(3)恩再適刺激的脾淋巴細胞上清液使Hep G2細胞增殖受到抑制,當上清液體積達到100%,與相同濃度恩再適單獨處理組相比,Hep G2細胞的增殖顯著抑制(P0.01)。(4)恩再適體內抑瘤活性:恩再適低、中、高劑量組的裸鼠體重變化曲線與空白對照組基本一致,各組之間沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。實驗結束時,恩再適低、中、高劑量組的抑瘤率分別為25.24%、34.71%、49.86%,脾臟指數分別為1.15、1.23、1.17,與空白對照組相比,各處理組均存在統(tǒng)計學差異(P0.05或P0.01)。(5)恩再適聯合給藥抑瘤效應:環(huán)磷酰胺低、高劑量組降低裸鼠體重,而恩再適組、聯合給藥組的裸鼠體重變化曲線與對照組基本一致,沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。實驗結束時,恩再適組,環(huán)磷酰胺低、高劑量組,聯合給藥組的抑瘤率分別為22.25%,33.21%,62.67%,60.95%,與對照組相比,各處理組均存在統(tǒng)計學差異(P0.01);與恩再適組或環(huán)磷酰胺低劑量組相比,聯合給藥組存在顯著性差異(P0.01);與環(huán)磷酰胺高劑量組相比,聯合給藥組的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與聯合給藥組的脾臟指數相比,恩再適組和環(huán)磷酰胺低、高劑量組均存在統(tǒng)計學差異(P0.05),與對照組沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。結論:恩再適一方面對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞具有增殖抑制的作用,另一方面,能夠通過上調體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-12的分泌水平,增強細胞免疫功能,進一步增強其抗腫瘤的作用。恩再適對機體無毒副作用,安全性高,能夠提高機體免疫功能,抑制裸鼠LM3皮下移植瘤的生長。恩再適還可以作為抗癌輔助藥與化療藥物環(huán)磷酰胺聯合使用,不僅能夠降低環(huán)磷酰胺用量以減輕其對機體的損害,還能夠起到抗瘤增效作用,預示恩再適在癌癥治療方面的應用前景十分廣闊。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96
【圖文】：

圖 1 恩再適對小鼠脾淋巴細胞上清中 IL-2（A）、IFN-γ （B）、IL-4（C）和 IL-12（D）的影響注：*P＜0.05，**P＜0.01，與陰性對照組比較； x±s，n=3Fig.1 The effect of analgecine on the IL- 2（A），IFN- γ （B），IL- 4（C） and IL-12（D） produced by the cultured mice splenic lymphocytes.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with control group； x±s，n=33.3 恩再適刺激淋巴細胞上清液對 HepG2 細胞增殖的影響淋巴細胞上清液中含有多種免疫活性因子，綜合上述 ELISA 檢測結果，采用恩再適 0.163 U/ml 刺激脾淋巴細胞上清液作用于 HepG2 細胞。結果如圖 2 所示，

圖 3 恩再適對 LM3 移植瘤裸鼠體重的影響（ x±s，n=6）Fig.3 Effect of analgecine on body weight of LM3 nude mice（ x±s，n=6）2 恩再適對人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用將人肝癌細胞 LM3 接種于 BALB/C 裸鼠皮下，接種后當腫瘤體積長至 100-30時，按照腫瘤體積隨機分組給藥，分為空白對照組，陽性對照組，恩再適低高劑量組共五組。使用游標卡尺測量腫瘤長徑（a）、短徑（b），計算腫瘤體，繪制腫瘤生長曲線。從各組的腫瘤體積增長情況來看，陽性對照組和恩再適中高劑量組在給藥第六天，與空白對照組相比較，已存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05圖 4），且抑瘤作用與計量有一定相關性。第十六天結束實驗時，空白對照組鼠的腫瘤重量為 1.01±0.24 g，陽性對照組的瘤重為 0.21±0.10 g，恩再適劑量組（0.01 U/g）、中劑量組（0.02 U/g）、高劑量組（0.04 U/g）的瘤重

圖 4 恩再適對 LM3 移植瘤裸鼠瘤體積的影響（ x±s，n=6）4 Effect of analgecine on tumor volume in LM3 transplanted nude mice（ x±

【參考文獻】

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本文編號：2753758