【摘要】：目的:促進抗原提呈細胞攝取、呈遞腫瘤抗原,是構建腫瘤疫苗需要考慮的重要因素。單純的腫瘤抗原免疫原性差,采用合適的負載體系對于增強抗原的攝取、提呈,特別是誘導T細胞免疫應答是非常重要的。本文通過多酚金屬的絡合作用,以單個細胞為模版,構建了負載腫瘤細胞裂解物的微顆粒體系,該體系能夠有效刺激抗原提呈細胞對腫瘤抗原的吞噬提呈并激活細胞免疫反應。本工作提供了一種通用、簡單、有效的腫瘤抗原包封策略,將單個腫瘤細胞包埋得到腫瘤疫苗,可以用于個體化免疫治療。方法:通過透射電鏡,掃描電鏡,共聚焦顯微鏡觀察TCL@EGCG/AIn微顆粒結構;利用X射線光電子能譜(XPS)及X射線能譜(EDS)檢測其組成成分;利用BCA法測定TCL@EGCG/AIn的蛋白負載能力及在不同pH環(huán)境下的蛋白釋放情況;通過激光共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy,LSCM)及流式細胞技術(Fluorescence Activated Cell Sorter,FACS)分析 DC 細胞對 TCL@EGCG/AIn的攝取;通過活體成像觀察TCL@EGCG/AIn負載的抗原蛋白在體內的遷移情況;采用流式細胞儀檢測TCL@EGCG/AIn促進骨髓來源樹突狀細胞成熟的能力;通過動物實驗模型觀察其預防治療以及抑制腫瘤轉移的效果。結論:成功制備了 EGCG/AI包裹腫瘤細胞裂解物的微顆粒疫苗,并確定了其形貌成球狀。該微顆粒疫苗具有較高的蛋白負載量及pH響應性蛋白釋放特性,在pH 5.5時釋放較快。細胞毒性結果顯示該具有良好的生物相容性,可以被BMDCs細胞攝取,并活化刺激BMDCs成熟。皮下注射微顆粒疫苗后6 h遷移至淋巴結,48小時內熒光不消失。動物實驗結果表明該微顆粒疫苗在一定程度上可以預防和抑制腫瘤的生長和轉移。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R943;R730.51
【圖文】：

（ｄ）為低倍鏡下ＳＥＭ圖像。可以看出ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１！微顆粒表面有塌陷現(xiàn)象，逡逑而ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微顆粒沒有，球形結構完整，說明ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微顆粒更穩(wěn)逡逑定。圖２－２（ｅ）（ｆ）為Ｂ１６細胞ＳＥＭ圖像，從圖中可以看出，Ｂ１６細胞表面光滑；逡逑與Ｂ１６細胞相比，微顆粒形貌成球形，表面粗糙，直徑約為７邋ｎｍ，略小于Ｂ１６細逡逑胞。ＳＥＭ在真空條件下進行，表明ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微顆粒具有良好的物理穩(wěn)定性。逡逑圖２－３為Ｂ１６細胞與ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微顆粒的ＴＥＭ超薄切片圖，從圖中可以看逡逑出，微顆粒表面有一層連續(xù)致密層包裹，與Ｂ１６細胞表面有明顯區(qū)別。逡逑１８逡逑

圖２－４邋（ａ）邋（ｂ）分別為ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩ標記的Ｂ１６細胞（ａ）和ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａｂ微顆粒（ｂ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４邋ＣＬＳＭ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋Ｂ１６邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｅｆｏｒｅ邋（ａ）邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋（ｂ）邋ｃｏａｔｉｎｇ邋ｂｙ邋ＥＧＣＧ／Ａ１邋ｌａｙｅｒ．逡逑由圖２－５邋Ｂ１６細胞與ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微顆粒的ＸＰＳ和ＥＤＳ圖譜可知，逡逑ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａｌ３邋由邋Ｃ、Ｎ、０、Ｎ、Ｓ、ＡＩ邋元素組成。對比邋Ｂ１６邋細胞與邋ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａｌ３逡逑的圖譜，ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３的ＸＰＳ和ＥＤＳ圖譜有ＡＩ元素的存在，而Ｂ１６無ＡＩ元逡逑素。上述實驗結果都證明了邋ＥＧＣＧ／ＡＩ結構的形成。逡逑Ｖａ；邋Ｃｌｓ邋８１．５０邐Ｗ邋ＣＩＳ邋６０．４３邋ｇ邋0逡逑廣ｖ邐Ｎｌｓ邐３．７４邐一邐Ｎｌｓ邐１８．１０逡逑＾邐Ｏｌｓ邐１３．３８邐２邐０１ｓ邐１８．６９逡逑３邐Ｐ２ｐ邐１．１１邐？邐Ｓ邐：ｄ邐Ａ１２ｐ邐１．０５逡逑ｔ邋＿邋」％邋０．２６邋°邋ｔ邋＃rP常rP櫻rP玻]3?Ｉ邋ｙｉ邋0邐？邋ＩＡＪ邐ｔ逡逑工邋ａ邐１邋一Ｈ逡逑＼＼邋ｏｐ邋Ｑ－邋0邐１邐ｃ／）0－＜Ｖ逡逑ｉ邐，邐ｉ邋■邋ｉ邋■邋ｉ邐，邐ｉ邐＇邐ｒ＊邐＊■邋ｉ－邐＞．邐邐ｉ邋■邐｜邐．邋ｉ邐，邐ｉ邐ｉ邋．Ｕ■—產(chǎn)？▲、逡逑１２００邋１０００邐８００邐６００邐４００邐２００邐０邐１２００邐１０００邐８００邐６００邐４００邐２００邐０逡逑Ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｅｎｅｒｇｙ邋（ｅＶ）邐Ｂｉｎ?

ｕｍｍｍ逡逑■■W逡逑圖２－６四種腫瘤細胞與其經(jīng)過ＥＧＣＧ／ＡＩ包裹后ＳＥＭ圖像逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－６邋ＳＥＭ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋４Ｔ１．邋ＣＴ２６，邋ＭＢ４９邋ａｎｄ邋ＨＬ－６０邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｃｏａｔｉｎｇ邋ｂｙ邋ＥＧＣＧ／Ａ１逡逑ｌａｙｅｒ．邋Ｕｎｃｏａｔｅｄ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｆｉｘｅｄ邋ｂｙ邋ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ邋ｆｏｌｌｏｗｅｄ邋ｂｙ邋ｗａｓｈｉｎｇ邋ｗｉｔｈ邋ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ邋ｗａｔｅｒ．逡逑為了驗證這種方法的通用性，我們嘗試了用另外三種鼠源腫瘤細胞：小鼠乳腺逡逑癌細胞（４Ｔ－１）、小鼠結腸癌細胞（ＣＴ－２６）、小鼠膀胱癌細胞（ＭＢ４９），一種人源腫逡逑瘤細胞：人急性早幼粒白血病細胞（ＨＬ－６０），以及一種鼠源非腫瘤細胞？．小鼠樹突逡逑狀細胞（ＤＣ邋２．４）進行包裹，并通過掃描電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察其形逡逑２１逡逑

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本文編號：2752100