發(fā)布時間：2020-07-09 14:28

【摘要】：惡性腫瘤是全球主要的致死疾病之一,嚴重威脅人類的健康。惡性腫瘤的臨床治療手段仍以手術和化療為主。但化療藥物通常具有溶解性差、毒性大、不具有靶向性等缺點,限制其廣泛的臨床應用。本文建立了一種細胞穿膜肽(CPP)修飾的自包封前體藥物及其共遞送體系用于遞送難溶性化療藥物。7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN38)是一種傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物,具有廣譜的抗腫瘤活性,但由于自身的理化性質、藥理學特點和毒性限制,使其很難應用于腫瘤的臨床治療。本文以SN38作為模型藥物,采用PEG與不同性質的CPP修飾SN38合成SN38前體藥物(CPP-PEG-SN38)改善其溶解性、提高細胞攝取。這些SN38前體藥物可以自組裝形成膠束,聚乙二醇(PEG)對CPP的電荷屏蔽作用使這些膠束可以應用于體內抗腫瘤研究。與陽性對照伊立替康(CPT-11)相比,這些CPP-PEG-SN38膠束在細胞攝取、體內體外抗腫瘤活性、組織分布等方面具有顯著的優(yōu)勢,并且優(yōu)化出具有最優(yōu)抗腫瘤活性的前體藥物(TAT-PEG-SN38)。但CPP-PEG-SN38并未改善CPT-11對組織的毒性。Survivin siRNA可以提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,為增強SN38靶向性、改善SN38抗腫瘤活性、降低SN38的組織毒性,本文建立了TAT-PEG-SN38與survivin siRNA的轉鐵蛋白(Tf)靶向脂質體共遞送體系(Tf-L-SN38/P/siRNA)。Survivin siRNA與魚精蛋白通過靜電吸附構成脂質體核心;磷脂與TAT-PEG-SN38作為遞送體系的中間層骨架;外層的Tf修飾為脂質體提供靶向能力。Tf-L-SN38/P/siRNA提高了survivin siRNA與TAT-PEG-SN38的抗腫瘤活性,并且與CPT-11相比,顯著降低了組織毒性。本論文研究內容主要涉及以下幾部分:1、CPP-PEG-SN38合成以PEG作為linker連接CPP與SN38,合成一系列CPP-PEG-SN38。采用三步法合成CPP-PEG-SN38:(1)合成5種C末端半胱氨酸修飾的CPP,5種CPP分別為R8、P28、PFV、SAP(E)和TAT。(2)以三光氣作為酰氯化試劑,將SN38的C_(10)位羥基酰氯化后,與OPSS-PEG_(2000)-OH通過酯鍵連接。(3)反應產物中加入半胱氨酸修飾的CPP與OPSS基團反應形成二硫鍵,合成CPP-PEG-SN38。CPP-PEG-SN38自組裝形成膠束,粒徑為124 nm到249 nm,并具有相對較低的電位。2、CPP-PEG-SN38體外抗腫瘤活性評價通過激光共聚焦與流式細胞儀對CPP-PEG-SN38的細胞攝取定性、定量分析,CPP-PEG-SN38可以被細胞完整地攝取,CPP-PEG-SN38的細胞攝取依賴CPP的疏水性與正電荷,TAT-PEG-SN38具有最高的細胞攝取率,并且具有細胞核靶向性。采用細胞攝取抑制劑處理細胞,研究不同CPP-PEG-SN38的攝取機制,發(fā)現(xiàn)CPP-PEG-SN38主要通過網格蛋白介導的內吞途徑進入細胞。CPP-PEG-SN38的體外抗腫瘤活性與CPP的性質密切相關,CPP-PEG-SN38的細胞毒性與細胞攝取具有相似的趨勢,并且CPP-PEG-SN38的細胞毒性具有時間、劑量依賴特性。在A549和MCF-7細胞中,TAT-PEG-SN38的細胞毒性分別為SN38的4.3、3.6倍。3、CPP-PEG-SN38體內抗腫瘤活性及毒性研究通過體外溶血實驗對CPP-PEG-SN38的血液相容性進行分析,CPP-PEG-SN38并未引起溶血或者凝聚現(xiàn)象,可以通過靜脈給藥。建立裸鼠A459細胞異位荷瘤模型評價CPP-PEG-SN38體內抗腫瘤活性,系列CPP-PEG-SN38膠束均具有顯著的抗腫瘤活性,TAT-PEG-SN38展現(xiàn)了最強的腫瘤生長抑制效果。與對照組和CPT-11給藥組相比,TAT-PEG-SN38分別抑制73.6%和61.4%的腫瘤生長。體外、體內抗腫瘤實驗證明:TAT-PEG-SN38具有最優(yōu)的抗腫瘤活性。通過體重、臟器病理切片評價CPP-PEG-SN38的毒性。TAT-PEG-SN38的毒性與CPT-11相似,并未顯著降低裸鼠體重。但臟器病理切片顯示TAT-PEG-SN38會對裸鼠的肝臟、小腸造成損傷,損傷程度和CPT-11相近。4、TAT-PEG-SN38的藥代動力學及組織分布建立血漿、組織中TAT-PEG-SN38、SN38和CPT-11的含量分析方法,研究大鼠給藥TAT-PEG-SN38和CPT-11后的藥代動力學,CPT-11的血藥濃度顯著高于TAT-PEG-SN38,TAT-PEG-SN38并未展現(xiàn)出抗腫瘤優(yōu)勢。建立裸鼠A549細胞荷瘤模型,分析TAT-PEG-SN38在裸鼠體內的組織分布。TAT-PEG-SN38在裸鼠腫瘤內大量積累,在腫瘤組織內TAT-PEG-SN38的AUC_(last)是CPT-11的37.5倍,TAT-PEG-SN38釋放的游離SN38的AUC_(last)是CPT-11的8.7倍。通過裸鼠活體成像進一步分析TAT對TAT-PEG-SN38在腫瘤內累積的影響,實驗結果證明:TAT可以促進SN38在腫瘤組織內累積,發(fā)揮更好的抗腫瘤活性。5、Tf-L-SN38/P/siRNA抗腫瘤活性評價SN38是一種具有廣譜抗腫瘤活性的拓撲異構酶I(TOPⅠ)抑制劑。然而SN38具有溶解性差、副作用強等缺點,雖然將SN38合成TAT-PEG-SN38前體藥物提高了抗腫瘤活性,但與CPT-11相比并未顯著改善組織毒性。Survivin在腫瘤細胞高表達,survivin蛋白具有抑制細胞凋亡,促進血管生成等作用。Survivin siRNA可以提高腫瘤細胞對SN38的敏感性,增強SN38的抗腫瘤活性。本文建立了共遞送survivin siRNA與TAT-PEG-SN38的靶向脂質體體系,以期提高TAT-PEG-SN38的抗腫瘤活性、降低組織毒性。Tf-L-SN38/P/siRNA的粒徑為148 nm,ζ-電位為+7.8 mV。當魚精蛋白與survivin siRNA通過靜電吸附形成脂質體核心時,脂質體具有更好的siRNA結合效率。Tf-L-SN38/P/siRNA可以將survivin siRNA與TAT-PEG-SN38同步地、等比例地轉載進入細胞,并且Tf與TAT-PEG-SN38顯著增強了Tf-L-SN38/P/siRNA的細胞攝取。細胞攝取機制研究結果顯示,Tf-L-SN38/P/siRNA主要通過轉鐵蛋白受體和網格蛋白介導的內吞途徑進入細胞。MTT實驗中,survivin siRNA脂質體對HeLa細胞的細胞毒性不顯著。在HeLa細胞中,Tf脂質體僅載藥TAT-PEG-SN38時,細胞毒性是SN38的1.25倍;但當survivin siRNA與TAT-PEG-SN38聯(lián)合給藥時,細胞毒性提高至SN38的14.56倍。采用Western blot評價Tf-L-SN38/P/siRNA對survivin基因的沉默作用。Tf與TAT-PEG-SN38可以增加脂質體對survivin siRNA的遞送效率,與survivin siRNA脂質體相比較,Tf-L-SN38/P/siRNA能顯著抑制HeLa細胞表達survivin蛋白。建立HeLa細胞裸鼠荷瘤模型評價Tf-L-SN38/P/siRNA體內抗腫瘤效果。L-siRNA的抗腫瘤作用有限。Tf-L-SN38/P/siRNA具有最有效的抗腫瘤活性,與對照組相比腫瘤增長抑制率為76.8%;與Tf-L-SN38相比,Tf-L-SN38/P/siRNA與siRNA共同給藥抑制了33.8%的腫瘤增長;與L-SN38/P/siRNA相比,Tf-L-SN38/P/siRNA在Tf靶向修飾后抑制了39.1%的腫瘤體積增長。并且Tf-L-SN38/P/siRNA給藥后對肝臟、腎臟和小腸沒有明顯損傷。以L-SN38/P/siRNA作為對照,活體成像進一步評估Tf-L-SN38/P/siRNA在體內的靶向效率。Tf修飾后脂質體在腫瘤部位具有更高的靶向性。綜上所述,本文建立了CPP修飾的自包封SN38前體藥物及其共遞送體系,并對其抗腫瘤活性進行評價,以期獲得抗腫瘤活性高、毒性低的SN38遞送體系。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R91
【圖文】：

完全恢復而 DNA 合成功能只有部分恢復[8有 TOP Ⅰ靶向性，當 TOP Ⅰ基因發(fā)生突變時。喜樹堿類化合物（CPTs）包括天然喜樹堿]，具有廣譜的抗腫瘤活性。CPTs 通過抑制 OP Ⅰ-DNA 形成中間復合體，抑制 DNA 的再 形成三元復合物，不與 TOP Ⅰ或 DNA 單獨導致 DNA 碎裂，誘導細胞凋亡[16, 17]。CP3,4-β）喹啉構成的六元環(huán)骨架（環(huán) A，B）xy- -lactone（環(huán) E）。在 C20具有一個手性中理活性是其同分異構體 20R-CPTs 的 10 ~ 1內酯環(huán) E 和吡啶酮環(huán) D 對拓撲異構酶抑制和 C10取代合成新的類似物，進而提高 CP于其強大的抗腫瘤活性引起了科學家的廣泛

瘤化合物 CPT 的一種半合成產物 C10位和 C7位分別通過乙基和羥基8 的分子量為 392.4 g/mol，在 25 °C 為 2.65[22]。SN38 幾乎不溶于水（11劑中也難以溶解，SN38 僅在 0.5%解，因此限制了 SN38 的直接給藥表明 SN38 在開環(huán)形式可以提高溶 pH 可逆水解，水解機制如圖 1.3 所酯水解，當 pH 值為 7.4 時，SN38完全以內酯形式存在；但當 pH > 9.，兩種形式的 SN38 處于等量的平活性，SN38 在生理條件下不穩(wěn)定，

SN38 的內酯依賴 pH 可逆水解，水解機制如圖 1.3 所示。手型中心 C20位的羥基可以促進 SN38 內酯水解，當 pH 值為 7.4 時，SN38 傾向于以羧酸鹽存在；當 pH 值≤ 4.5，SN38 完全以內酯形式存在；但當 pH > 9.0 時，SN38 完全以羧酸鹽存在；在 pH = 6.7 時，兩種形式的 SN38 處于等量的平衡狀態(tài)[22, 24]。羧酸鹽形式的 SN38 不具有生理活性，SN38 在生理條件下不穩(wěn)定，這是 SN38 提供有效治療的一個主要障礙。圖 1.2 SN38 的化學結構Figure 1.2 Chemical structure of SN38

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本文編號：2747582