發(fā)布時間：2020-07-06 05:52

【摘要】：目的:探討烏司他丁對氧化損傷海馬神經(jīng)元線粒體能量代謝、膜電位變化,以及凋亡相關蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(BCL-2)、線粒體鈣單向轉運蛋白(MCU)的影響和可能的機制。方法:分離SD胎鼠海馬,采用無血清培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元,取培養(yǎng)至第9天的神經(jīng)元,采用H2O2建立氧化應激損傷模型,分為空白對照組(N),H2O2組(H),烏司他丁預處理1000u/ml+H2O2組(UTI1+H),烏司他丁預處理2000u/ml+H2O2組(UTI2+H),倒置相差顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)的改變,酶標儀檢測神經(jīng)元的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性;熒光顯微鏡觀察JC-1法檢測線粒體膜電位變化;Annexin-V-Fluorescein/PI雙染法和Hoechst33342/PI雙染法測神經(jīng)元凋亡率;采用RT-PCR及Western-blot檢測BCL-2、MCU蛋白的表達。結果:1、采用無血清培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元生長良好,培養(yǎng)8-14天的神經(jīng)元長勢最好,細胞核立體感強,軸突聯(lián)接成網(wǎng)絡,神經(jīng)元純度為92.05%,滿足實驗要求。2、各組形態(tài)改變,H組可見神經(jīng)元胞漿濃縮,細胞核邊集,胞間隙增大,軸突斷裂,少部分細胞懸浮。UTI1+H和UTI2+H組可見細胞保持完整形態(tài),部份細胞皺縮,胞體有光暈。3、ATP酶的測定:與N組比較,H組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低(P0.05),與H組比較,UTI1+H和UTI2+H組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性升高(P0.05),UTI1+H和UTI2+H組間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4、對細胞凋亡相關指標的影響:與N組比較,H組線粒體膜電位降低、凋亡率升高(P0.05),與H組比較,UTI1+H和UTI2+H組線粒體膜電位升高、凋亡率降低(P0.05),UTI1+H和UTI2+H組間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5、BCL-2、MCU的表達:與N組比較,H組BCL-2蛋白表達降低,MCU蛋白表達增加(P0.05),與H組比較,UTI1+H和UTI2+H組BCL-2蛋白表達增加,MCU表達降低(P0.05),UTI1+H和UTI2+H組間BCL-2表達差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),MCU表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1、氧化應激損傷的神經(jīng)元可導致能量代謝障礙、線粒體膜電勢能降低、細胞凋亡等病理改變。2、經(jīng)過濃度為1000U/ml、2000U/ml烏司他丁預處理可以抑制H2O2誘導的海馬神經(jīng)元細胞氧化應激損傷,這可能與其維持細胞能量代謝、穩(wěn)定線粒體膜電位,升高BCL-2表達,降低MCU表達,從而降低細胞凋亡率有關。
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96
【圖文】：

9 SD 大鼠孕鼠剖腹取出胎鼠 B：胎鼠 C：體視顯微鏡下未分離海馬組織 D圖 1 胎鼠海馬組織Fig.1 Hippocampus of prenatal rat光學顯微鏡下海馬神經(jīng)元的形態(tài)變化觀察(圖 2)

注 A：Day1 細胞基本貼壁，胞體透亮，周圍有光暈可見短小突觸 （×100）； B：Day5 細胞伸出突觸，胞體立體感強（×100）；C:Day8 神經(jīng)元突觸較長，胞體形圓（×100）；D：Day10 神經(jīng)元交織成網(wǎng)絡（×100）；E:Day16 神經(jīng)元突起交織成網(wǎng)絡，胞體相對變小，光暈減弱（×100）；F：Day20神經(jīng)元折光性弱，細胞變形，突起連續(xù)性差，部分細胞開始裂解（×100）圖 2 光學顯微鏡下不同時間點海馬神經(jīng)元的形態(tài)觀察

- 29 -注 A：Day8 神經(jīng)元免疫熒光，細胞核 DAPI 標記藍色熒光（×200）；B：Day8 神經(jīng)元，免疫熒光β-Ⅲ Tublin 標記胞漿和突觸綠色熒光（×200）；C：merged。圖 3 海馬神經(jīng)元免疫熒光鑒定Fig.3 immune fluorescent identification of hippocampal neurons

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本文編號：2743250