【摘要】：隨著物質(zhì)生活水平的提高,人們在飲食方面發(fā)生了改變,與飲食相關(guān)疾病的發(fā)病率持續(xù)上升。糖尿病是其中最為常見、發(fā)病率最高的流行性疾病之一。糖尿病有眾多并發(fā)癥,糖尿病血管并發(fā)癥則是導致糖尿病病人發(fā)病和死亡的首要原因。體內(nèi)血糖水平持續(xù)升高的情況下,會造成晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)生成速度加快,其會沉積在血管壁上,難以消除。研究證實,AGEs與RAGE(the Receptor of Advanced Glycation End products)結(jié)合后,激活氧化應激并誘導產(chǎn)生活性氧(ROS),導致細胞因子分泌異常,并激活細胞內(nèi)的信號通路,最終導致內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)的改變和功能的紊亂。因此,降低或抑制AGEs的生成可能會有效延緩和預防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。目前,許多化學藥物已被用于預防糖尿病并發(fā)癥以及與AGEs相關(guān)疾病的治療。但長期使用可能會出現(xiàn)如胃腸道不適及肝中毒等副作用,因此,天然抗氧化劑成為防治AGEs形成以及治療糖尿病并發(fā)癥的最有前景的藥物之一。實驗室前期已發(fā)現(xiàn)APRF和雪菊花色苷均具有抗氧化活性,本研究將進一步考察這兩種花色苷體外抑制AGEs生成能力;以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)為實驗材料,研究兩種花色苷對AGEs損傷HUVEC細胞的保護作用及相關(guān)作用機制。本實驗通過體外制備AGEs,采用紫外分光光度法、熒光分光度法和SDS-PAGE等鑒定AGEs的生成;并采用熒光分光光度法、圓二色譜及SDS-PAGE等方法檢測 APRF(APRF)(0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL)和雪菊花色苷(ACTN)(0.075 mg/mL、0.15 mg/mL、0.3 mg/mL)體外抑制 AGEs 作用;鏡下觀察 APRF(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL)和 ACTN(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)預處理1 h再加入AGEs(200 μg/mL)作用24 h后對細胞形態(tài)的影響;通過DCFH-DA染色檢測AGEs(200 μg/mL)處理24 h胞內(nèi)活性氧(ROS)生成水平;及兩種花色苷預處理1 h后再加入AGEs(200 μg/mL)作用24 h后胞內(nèi)ROS水平的變化;Real-Time PCR 檢測 AGEs(200 μg/mL)損傷組、AGEs+ APRF(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL)干預組以及 AGEs+ACTN(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)干預組的細胞粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、炎癥因子(ICAM-1、VCAM-1、IL-1β、IL-18、CRP、NLRP3、Caspase-1)、和 DNA 修復酶(MTH1、PARP-1)等相關(guān)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平;Western blot方法分別檢測AGEs(200 μg/mL)損傷組、AGEs+APRF(0.2mg/mL、0.4mg/mL)干預組、AGEs+ACTN(0.5mg/mL、1.0 mg/mL)干預組細胞的NF-κBp65磷酸化蛋白和總蛋白p38MAPK表達、P-IκB磷酸化蛋白、IκB蛋白、Nrf2總蛋白和核蛋白的表達。結(jié)果表明:BSA與葡萄糖在37 ℃、無菌條件下培養(yǎng)6周后生成AGEs;熒光光譜、圓二色譜及SDS-PAGE方法結(jié)果顯示,與AGEs組相比,兩種花色苷均可以體外抑制AGEs的生成;鏡下結(jié)果表明APRF(0.2mg/mL、0.4mg/mL)和雪菊花色苷(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)預處理后,可顯著抑制AGEs損傷HUVECs細胞;DCFH-DA染色實驗結(jié)果表明花色苷干預受損的HUVECs細胞后,均能夠顯著降低細胞ROS生成水平;Real-Time PCR實驗結(jié)果顯示,與空白對照組相比,AGEs損傷組細胞內(nèi)相關(guān)因子表達量顯著上調(diào)。AGEs+花色苷干預組以濃度-劑量(?)estern blot實驗結(jié)果表明,與空白對照組相比,白對照組相比,各組間細胞p38 MAPK磷酸化蛋白和NF-κB p65磷酸化蛋白、P-IκB磷酸化蛋白以及核蛋白Nrf2表達顯著性升高(p0.05),Nrf2、NF-κB p65、p38 MAPK和IκκB蛋白表達未出現(xiàn)變化。說明兩種花色苷可以通過抑制AGEs激活血管內(nèi)皮細胞Nrf2、p38MAPK、NF-κBp65以及P-IκB信號通路而發(fā)揮細胞保護作用。以上結(jié)果表明兩種花色苷均可以體外抑制AGEs的生成并通過抑制氧化應激、降低細胞炎癥因子的表達、阻斷細胞相應的信號通路,從而抑制AGEs誘導的HUVECs損傷。本實驗為APRF和ACTN應用到抗糖化及糖尿病動脈粥樣硬化藥物研究提供一定的實驗依據(jù)。
【學位授予單位】：遼寧大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R91
【圖文】：

（邋／；＜０．０５勾ＡＧＥｓ組相比差異顯著）逡逑１．５．邐３．邋２邋ＢＳＡ／Ｇｌｕｃｏｓｅ反應體系中ＡＣＴＮ對ＡＧＥｓ的抑制作用逡逑圖４邋（Ａ）為ＢＳＡ／Ｇｌｕｃｏｓｅ反應體系中ＡＣＴＮ對ＡＧＥｓ生成抑制作用的熒光逡逑強度光譜。圖４邋（Ｂ）為ＡＣＴＮ對ＡＧＥｓ生成抑制率結(jié)果。與未發(fā)生糖基化反應逡逑的ＢＳＡ相比，ＡＧＥ－ＢＳＡ的特征性熒光增加約４．５倍。當ＡＣＴＮ被添加到由葡逡逑萄糖介導的ＢＳＡ反應體系屮時，其熒光強度以濃度－劑量依賴性方式降低。逡逑結(jié)果表明，隨ＢＳＡ／Ｇｌｕｃｏｓｅ反應體系中添加ＡＣＴＮ濃度的增加，ＡＣＴＮ對逡逑１８逡逑

而同時添加ＡＰＲＦ后，蛋白質(zhì)的：級結(jié)構(gòu)的ａ－螺旋含量從４０．１２％分逡逑別上升到邋４２．１４％邋（０．１２５邋ｍｇ／ｍＬ）、４４．１８％邋（０．２５邋ｍｇ／ｍＬ）。這表明邋ＡＰＲＦ邋能夠穩(wěn)逡逑定ＢＳＡ的結(jié)構(gòu)并阻止ＢＳＡ發(fā)生糖基化（圖５）。此外，結(jié)果也表明ＡＰＲＦ抑諱ＩＪ逡逑ＢＳＡ結(jié)構(gòu)的損失具有濃度－劑量依賴性。逡逑１９逡逑

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本文編號：2732925