【摘要】：目的觀察紅霉素聯(lián)合地塞米松對慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者外周血單個核細胞炎癥作用的影響。 方法入選吸煙的COPD患者及無吸煙史的健康志愿者各10例，抽取適量外周血，在無菌條件下應用泛影鈉不連續(xù)密度梯度離心法分離得到外周血單個核細胞（PBMCs）。健康志愿者PBMCs設為正常對照組，COPD患者的PBMCs又分為COPD組，紅霉素組及聯(lián)合治療組（紅霉素+地塞米松）。紅霉素組給予紅霉素（10μg/ml）預孵育2小時，再給予不同濃度的地塞米松（10-6-10-12mol/L）孵育1小時后予TNF-α刺激過夜；健康對照組及COPD組應用培養(yǎng)基代替紅霉素；紅霉素聯(lián)合激素組的PBMCs給予紅霉素及地塞米松（10-6mol/L）預孵育2小時，再給予不同濃度的地塞米松（10-6-10-12mol/L）孵育1小時后予TNF-α刺激過夜。經(jīng)培養(yǎng)后，應用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測細胞培養(yǎng)上清液中白細胞介素（Interleukin，IL）-8的水平，根據(jù)不同濃度地塞米松對應的IL-8抑制率繪制半對數(shù)曲線，應用Microsoft Excel2003計算IL-8抑制率及地塞米松半數(shù)抑制濃度（IC50-Dex），應用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件完善統(tǒng)計學分析。 結(jié)果（1）地塞米松在10-10-10-6的濃度時，COPD組的IL-8抑制率（10-6：51.10±3.02%，10-7：50.08±3.30%，10-8：50.20±2.55%，10-9：46.80±2.38%，10-10：25.50±3.00%）明顯低于健康對照組（77.08±2.80%，76.51±3.52%，73.60±3.52%，68.30±3.02%，50.51±2.43%），均P0.05；COPD組IC50-Dex為54.9±2.2nmol/μL，明顯高于健康對照組（0.20±0.08nmol/μL），P0.05。（2）地塞米松在10-10-10-6的濃度時，紅霉素組的IL-8抑制率（10-6：55.82±3.11%，10-7：52.23±3.31%，10-8：51.68±2.43%，10-9：48.92±2.29%，10-10：29.98±3.07%）以及聯(lián)合治療組IL-8抑制率（70.88±4.29%，69.52±3.22%，66.18±2.60%，62.28±2.62%，42.53±2.46%）均明顯高于COPD組，其中聯(lián)合治療組對IL-8的抑制較紅霉素組更加明顯，均P0.05。紅霉素組IC50-Dex（5.67±1.15nmol/μL）及聯(lián)合治療組IC50-Dex（1.03±0.06nmol/μL）明顯低于COPD組，其中聯(lián)合治療組較紅霉素組更加顯著，均P0.05。 結(jié)論（1）吸煙的COPD患者IC50-Dex升高，提示存在糖皮質(zhì)激素抵抗；（2）紅霉素及聯(lián)合地塞米松的IC50-Dex低于COPD組，IL-8的釋放減少，表明紅霉素聯(lián)合地塞米松能夠減輕糖皮質(zhì)激素抵抗，增加抗炎效果，聯(lián)合治療較單獨應用紅霉素更加顯著。 目的觀察紅霉素聯(lián)合地塞米松對煙草煙霧暴露下人單核細胞炎癥作用的影響。 方法以U937細胞株為研究對象，分為：對照組，煙草煙霧提取物（CSE）組，紅霉素組及聯(lián)合治療組（紅霉素+地塞米松）。紅霉素組的細胞給予紅霉素（10μg/ml）預孵育2小時后給予CSE刺激過夜，之后給予不同濃度的地塞米松（10-6-10-12mol/L）孵育1小時后予TNF-α刺激過夜；CSE組應用培養(yǎng)基代替紅霉素，其余干預措施同紅霉素組；對照組僅給予不同濃度激素及TNF-α，紅霉素及CSE均由培養(yǎng)基代替；聯(lián)合治療組的細胞給予紅霉素及地塞米松（10-6mol/L）預孵育2小時后給予CSE刺激過夜，之后給予不同濃度的地塞米松（10-6-10-12mol/L）孵育1小時后予TNF-α刺激過夜。經(jīng)培養(yǎng)后，應用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測細胞培養(yǎng)上清液中白細胞介素（Interleukin，IL）-8的水平，根據(jù)不同濃度地塞米松對應的IL-8抑制率繪制半對數(shù)曲線，應用Microsoft Excel2003計算IL-8抑制率及地塞米松半數(shù)抑制濃度（IC50-Dex）。應用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件完善統(tǒng)計學分析。 結(jié)果（1）地塞米松在10-10-10-6的濃度時，CSE組的IL-8抑制率（10-6：44.79±3.32%，10-7：42.44±3.50%，10-8：39.25±2.60%，10-9：35.20±2.40%，10-10：14.92±3.18%）明顯低于對照組（61.05±3.15%，60.78±3.70%，59.12±2.37%，55.20±2.52%，37.71±3.43%），CSE組的IC50-Dex為762.90±66.85nmol/μL，明顯高于對照組（5.72±1.10nmol/μL），均P0.05。（2）地塞米松在10-10-10-6的濃度時，紅霉素組的IL-8抑制率（10-6：55.59±3.26%，10-7：53.66±3.11%，10-8：50.85±2.55%，10-9：45.49±2.82%，10-10：29.54±2.66%）及聯(lián)合治療組的IL-8抑制率（49.93±3.36%，48.26±3.51%，45.28±2.63%，40.03±2.39%，22.05±3.16%）高于CSE組，其中聯(lián)合治療組對IL-8的抑制較紅霉素組更加明顯，均P0.05。紅霉素組IC50-Dex（112.57±17.88nmol/μL）及聯(lián)合治療組（24.36±7.28nmol/μL）明顯低于COPD組，其中聯(lián)合治療組較紅霉素組更加顯著，均P0.05。 結(jié)論（1）CSE組的IC50-Dex升高，提示煙草煙霧暴露下的人單核細胞存在糖皮質(zhì)激素抵抗；（2）紅霉素及聯(lián)合地塞米松的IC50-Dex低于CSE組，IL-8的釋放減少，表明紅霉素及聯(lián)合地塞米松能夠減輕糖皮質(zhì)激素抵抗，增加抗炎效果，聯(lián)合治療較單獨紅霉素更加顯著。 目的觀察紅霉素聯(lián)合地塞米松是否通過抑制PI3K-δ/Akt傳導通路及增加HDAC2蛋白的表達而減輕煙草煙霧暴露下人單胞細胞的糖皮質(zhì)激素抵抗，增加抗炎效果。 方法以U937細胞株為研究對象，主要分為兩部分進行觀察研究：（1）首先觀察抑制劑是否能夠減輕糖皮質(zhì)激素抵抗：將培養(yǎng)的U937細胞分為對照組，CSE組及抑制劑組。抑制劑組的細胞給予PI3K-δ抑制劑（IC87114:1μM）預孵育2小時后給予CSE刺激過夜，之后給予不同濃度的地塞米松（10-6-10-12mol/L）孵育1小時后予TNF-α刺激過夜；CSE組應用培養(yǎng)基代替IC87114，其余干預措施同紅霉素組；對照組患者僅給予不同濃度激素及TNF-α，紅霉素及CSE均由培養(yǎng)基代替。經(jīng)培養(yǎng)后，應用ELISA檢測白細胞介素（IL-8）的水平，根據(jù)不同濃度地塞米松對應的IL-8抑制率繪制半對數(shù)曲線，計算IL-8抑制率及地塞米松半數(shù)抑制濃度（IC50-Dex）；（2）進一步觀察紅霉素及聯(lián)合地塞米松減輕煙草煙霧下單核細胞炎癥反應的機制：將培養(yǎng)的U937細胞分為對照組，CSE組，地塞米松組，紅霉素組，聯(lián)合治療組及抑制劑組。紅霉素組的細胞給予紅霉素（10μg/ml）預孵育2小時后給予CSE刺激過夜，再給予TNF-α刺激過夜；CSE組應用培養(yǎng)液代替紅霉素，其他干預措施同紅霉素組；抑制劑組的細胞給予IC87114（1μM）預孵育2小時后給予CSE刺激過夜，再給予TNF-α刺激過夜；Dex組的細胞給予地塞米松（10-6mol/L）預孵育2小時后給予CSE刺激過夜，再予TNF-α刺激過夜；紅霉素聯(lián)合激素組的細胞給予紅霉素及地塞米松預孵育2小時后給予CSE刺激過夜，之后再予TNF-α刺激過夜；對照組只給予TNF-α刺激，其余干預措施均由培養(yǎng)液代替。經(jīng)以上培養(yǎng)干預后，應用Westernblotting檢測各組細胞內(nèi)組蛋白去乙酰化酶II（HDAC2），PAkt及Akt的表達；應用RT-PCR檢測各組細胞HDAC2mRNA的表達；應用HDAC活性檢測試劑盒檢測總HDAC活性；應用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件完善統(tǒng)計學分析。 結(jié)果（1）地塞米松在10-10-10-6的濃度時，CSE組的IL-8抑制率（10-6：44.79±3.32%，10-7：42.44±3.50%，10-8：39.25±2.60%，10-9：35.20±2.40%，10-10：14.92±3.18%）明顯低于對照組（61.05±3.15%，60.78±3.70%，59.12±2.37%，55.20±2.52%，37.71±3.43%）及抑制劑組（56.70±2.82%，54.45±2.67%，52.96±2.33%，46.82±3.02%，30.14±2.86%），P0.05。（2）CSE組的IC50-Dex為762.9±66.8nmol/μL，明顯高于對照組（5.7±1.1nmol/μL）及抑制劑組（14.1±3.8nmol/μL），P0.05。（3）CSE組的HDAC2蛋白表達明顯低于空白對照組，紅霉素組及聯(lián)合治療組，其中聯(lián)合治療組HDAC2蛋白的表達明顯高于紅霉素組，均P0.05；作為陽性對照，抑制劑組的HDAC2蛋白表達亦明顯高于CSE組，P0.05，Dex組及CSE組相比無統(tǒng)計學差異，P0.05。（4）CSE組的HDAC2mRNA明顯低于空白對照組，紅霉素組及聯(lián)合治療組，其中聯(lián)合治療組HDAC2mRNA明顯高于紅霉素組，均P0.05；作為陽性對照，抑制劑組的HDAC2mRNA表達亦明顯高于CSE組，P0.05；Dex組及CSE組相比無統(tǒng)計學差異，P0.05。（5）CSE組的總HDAC活性明顯低于紅霉素組、聯(lián)合治療組及抑制劑組，P0.05；紅霉素組、聯(lián)合治療組及抑制劑組相比無統(tǒng)計學差異，P0.05；CSE組與Dex組相比無統(tǒng)計學差異，P0.05。（6）CSE組的PAkt表達明顯高于紅霉素組及聯(lián)合治療組，其中聯(lián)合治療組明顯高于紅霉素組，均P0.05；作為陽性對照，IC87114同樣能減少PAkt的表達，P0.05；CSE組與Dex組相比無統(tǒng)計學差異，P0.05。（7）各組總Akt表達無統(tǒng)計學差異，P0.05。 結(jié)論（1）PI3K-δ抑制劑組的IC50-Dex低于CSE組，說明PI3K-δ抑制劑可減輕糖皮質(zhì)激素抵抗；（2）紅霉素聯(lián)合地塞米松可增加煙草煙霧暴露下人單核細胞HDAC2的表達，減少PAkt的表達，較單獨紅霉素更加明顯。因此，紅霉素聯(lián)合地塞米松通過抑制PI3K-δ/Akt途徑及增加HDAC2蛋白的表達減輕煙草煙霧暴露下人單核細胞的糖皮質(zhì)激素抵抗，增加抗炎效果，較單獨紅霉素更加顯著。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R96
【圖文】：

對照組比較：24小時，256.77 ± 18.65 vs 102.55 ± 8.52；48小時，298vs 122.75 ± 11.25；72 小時：330.25 ± 18.83 vs 152.22 ± 11.95）。紅μg/ml）預孵育后再給予 TNF-α 刺激，可觀察到單個核細胞表達 I顯下降（TNF-α 組和紅霉素組比較：24 小時，256.77 ± 18.65 v14.15；48 小時，298.25 ± 25.88 vs 180.33 ± 17.25；72 小時：330.2205.75 ± 12.28）。因此，紅霉素 10 μg/ml 能夠明顯的抑制單個核細反應。

10-8：50.20 ± 2.55 %，10-9：46.80 ± 2.38 %，10-1健康對照組（77.08 ± 2.80 %，76.51 ± 3.52 %，7%，50.51 ± 2.43 %），紅霉素組（55.82 ± 3.11 %，.43 %，48.92 ± 2.29 %，29.98 ± 3.07 %）以及聯(lián)合.52 ± 3.22 %，66.18 ± 2.60 %，62.28 ± 2.62%，42組對 IL-8 的抑制較紅霉素組更加明顯，均 P<0

【參考文獻】

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1 胡瑞成,徐永健,張珍祥,謝俊剛;白細胞介素-10基因啟動子多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)系[J];中華醫(yī)學遺傳學雜志;2003年06期

2 安立;林英翔;龐寶森;張鴻;逯勇;焦霞;張曙;楊汀;;轉(zhuǎn)化生長因子-β1與中國北方漢族慢性阻塞性肺疾病及其肺功能表型的相關(guān)性研究[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2011年08期

本文編號：2730011