發(fā)布時間：2020-06-26 03:31

【摘要】：目的:神經(jīng)母細胞瘤是兒童中最常見的實體瘤,并且在患有遠處轉(zhuǎn)移和/或MYCN癌基因擴增的患者中是高度惡性的,超過12個月。由于其特定的位置,神經(jīng)元腫瘤在手術(shù)后復發(fā)率很高,因此死亡率極高,并且發(fā)病率也很高。目前,用于治療神經(jīng)內(nèi)膜腫瘤的藥物靶向性差,難以獲得所需的治療效果,并且藥物本身也具有高的不良副作用發(fā)生率。因此,開發(fā)一種用于治療神經(jīng)腫瘤的低毒,高效的靶向藥物是一項緊迫的任務(wù)。肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)是由厭氧梭菌肉毒桿菌產(chǎn)生的外毒素,具有7種血清型的A-G(3)。BoNT的結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域非常保守,其前體是分子量約150KD的單一多肽鏈。前體被內(nèi)源或外源蛋白水解酶分解成通過兩個硫鍵連接的活性雙鏈結(jié)構(gòu):輕鏈(LC,50KD)是具有內(nèi)肽酶活性的催化結(jié)構(gòu)域;重鏈(HC,100KD)是一種細胞結(jié)合和易位結(jié)構(gòu)域,可以介導細胞膜上特定受體和神經(jīng)毒素之間的結(jié)合。據(jù)文獻報道,肉毒桿菌毒素可抑制人神經(jīng)肌肉接頭處神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放,導致一系列弛緩性麻痹癥狀。此外,肉毒桿菌毒素可以阻斷神經(jīng)和肌肉之間的“信息傳遞”,使過度收縮的肌肉松弛,皺紋消失,在美容上應(yīng)用很廣泛。雖然肉毒桿菌毒素在治療中樞性疾病中有許多應(yīng)用,但作為生物大分子,很難通過血腦屏障,這極大地限制了它們的應(yīng)用。許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病都位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),要想使其所攜帶的藥物進入神經(jīng)其系統(tǒng)必須要解決如何通過血腦屏障的問題。雖然肉毒素作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的靶向載體已有報道,但是有很多的毒副作用。最近的研究表明,TAT肽融合蛋白可通過外周血通過血腦屏障進入大腦。TAT肽是由HIV Tat蛋白的轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域的11個氨基酸殘基組成。與傳統(tǒng)的腦內(nèi)注射相比,TAT介導的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導技術(shù)可以將生物大分子遞送到大腦,而不會引起腦組織的感染和創(chuàng)傷。迄今已報道了許多TAT融合蛋白,例如TAT-14-3-3?,TAT-Bcl-xL,TAT-球蛋白和TATPARK7。它們能夠有效地穿過BBB并在腦疾病的動物模型中顯示出顯著的神經(jīng)保護作用。本研究構(gòu)建了pET-28a-TAT-EGFP-HCS和pET-28a-TAT-EGFP-LC質(zhì)粒,并表達純化,驗證了生物活性;用蛋白EGFP、TAT-EGFP、TAT-EGFP-LC、TAT-EGFP-HCS與PC12細胞、BV2細胞、C6細胞和HeLa細胞共孵育實驗,驗證了TAT-EGFP-LC是否可以這些細胞的細胞膜以及穿膜能力的比較;驗證了蛋白TAT-EGFP-HCS在小鼠體內(nèi)對于心腦肝腎組織穿膜能力。研究方法:1.TAT-EGFP-HCS、SNAP-25、LC和TAT-EGFP-LC的質(zhì)粒構(gòu)建、表達、檢測和活性測定對質(zhì)粒進行雙酶切,將酶切后的pET-28aTAT-EGFP和HCS進行連接,然后進行轉(zhuǎn)化實驗,轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細胞中進行挑單克隆擴增細菌,擴增、雙酶切反應(yīng),電泳鑒定。將連接后質(zhì)粒pET-28aTAT-EGFP-HCS進行轉(zhuǎn)化,挑單克隆進行擴增培養(yǎng),繼續(xù)擴增培養(yǎng),然后進行SDS-PAGE電泳和Western-Blot;電泳和Western-Blot驗證后進行蛋白純化實驗,大量表達后,收集細菌,進行蛋白純化,用HIS標簽蛋白純化柱對其進行純化,純化后用透析袋對蛋白進行鹽析,之后進行保存;按照同樣的方法構(gòu)建質(zhì)粒pET-28a-TAT-EGFP-LC、pET-28a-LC和pET-28a-SNAP-25,然后進行表達純化,得到蛋白后進行LC、TAT-EGFP-LC酶切SNAP-25活力測定,以購買的肉毒素酶切SNAP-25作為對照,然后進行SDS-PAGE電泳,Western-Blot鑒定,利用SNAP-25抗體進行特異性檢測,驗證蛋白LC、TAT-EGFP-LC的酶切活力。培養(yǎng)PC12細胞,加入蛋白LC和TAT-EGFP-LC與細胞共同孵育,提取蛋白液體,進行Western-Blot鑒定,檢驗蛋白LC是否可以穿過細胞膜,是否能發(fā)揮酶作用切開PC12細胞中的SNAP-25。2.蛋白EGFP、TAT-EGFP-HCS、TAT-EGGP-LC、TAT-EGFP對PC12,BV2,C6以及Hela細胞的穿膜能力分別培養(yǎng)PC12細胞、BV2細胞、C6細胞和HeLa細胞,待細胞長好后傳代于六孔板中,然后進行蛋白EGFP、TAT-EGFP、TAT-EGFP-HCS和TAT-EGFP-LC與細胞共孵育實驗,加入新鮮培養(yǎng)液,熒光顯微鏡照相,觀察EGFP、TAT-EGFP、TAT-EGFP-HCS和TAT-EGFP-LC穿膜情況,用流式細胞儀再次分析穿膜的結(jié)果3.蛋白EGFP、TAT-EGFP-HCS、TAT-EGGP-LC、TAT-EGFP對PC12細胞的凋亡的影響用蛋白TAT-EGFP-HCS、TAT-EGFP、EGFP、TAT-EGFP-LC與PC12細胞共同孵育,收集樣品,進行流式細胞儀檢測,驗證這幾種蛋白對PC12細胞是否可能引起細胞凋亡。4.蛋白TAT-EGFP-HCS在小鼠組織中的分布將蛋白TAT-EGFP-HCS進行C57BL/6小鼠尾靜脈體內(nèi)注射,取小鼠組織心腦肝腎,制備成冰凍切片,用熒光顯微鏡觀察蛋白對組織穿膜情況。結(jié)果:1.成功構(gòu)建了質(zhì)粒ET-28a-TAT-EGFP-HCS、pET-28a-SNAP-25、pET-28a-TAT-EGFP-LC、pET-28a-LC,經(jīng)過表達后SDS-PAGE電泳鑒定,與理論值一致,說明表達成功,并且證明蛋白SNAP-25、TAT-EGFP-HC、LC和TAT-EGFP-LC在體外具有很好的生物活性;2.通過蛋白EGFP、TAT-EGFP、TAT-EGFP-HCS、TAT-EGFP-LC與細胞共孵育實驗,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TAT-EGFP-HCS對神經(jīng)細胞PC12細胞、BV2細胞、C6細胞和HeLa細胞穿膜作用相對較強,而TAT-EGFP-LC穿膜能力較弱并且EGFP蛋白并無細胞穿膜能力,證實TAT-EGFP-HCS具有特異性的細胞穿膜作用;經(jīng)過流式細胞儀檢測,得到類似的結(jié)果。3.蛋白TAT-EGFP-HCS、TAT-EGFP、EGFP、TAT-EGFP-LC與PC12細胞共同孵育后,用流式細胞術(shù)測得蛋白TAT-EGFP-LC可以引起PC12細胞的早期凋亡,而蛋白EGFP,TAT-EGFP,TAT-EGFP-HCS對細胞的凋亡情況沒有影響。4.分別比較將TAT-EGFP-HCS蛋白尾靜脈注射小鼠后腦肝心腎的分布情況,發(fā)現(xiàn)TAT-EGFP-HCS對小鼠腦組織穿透能力較強,對其他組織穿透能力明顯弱于腦組織。結(jié)論:1.蛋白EGFP、TAT-EGFP、TAT-EGFP-HCS在體外表達的生物學活性,未看到明顯的細胞毒副作用,與細胞共同孵育后,細胞依然生長良好,而蛋白TAT-EGFP-LC可引起細胞凋亡;2.體外實驗顯示,TAT-EGFP-HCS具有特異性的穿透神經(jīng)細胞的作用,并且穿透能力強于TAT-EGFP,而TAT-EGFP-LC的穿膜能力較差;在非神經(jīng)細胞HeLa細胞中穿膜能力弱于TAT-EGFP;3.表達的肉毒素重鏈TAT-EGFP-HCS具有明顯的神經(jīng)導向作用蛋白,在小鼠體內(nèi)蛋白TAT-EGFP-HCS具有特異性的穿透血腦屏障作用,能進入小鼠大腦。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R91
【圖文】：

圖 1.1 顯微鏡下觀察到的肉毒桿菌示意圖肉毒素毒性最大的片段由 50KD 的輕鏈（氨基酸序列為 1-448）和 100KD 的（氨基酸序列為 449-1296）構(gòu)成，輕鏈和重鏈通過二硫鍵（C430-C454）連接[42]。圖 1.2 肉毒素結(jié)構(gòu)示意圖肉毒素和神經(jīng)細胞的識別是通過肉毒素重鏈的羧基端(HCc)和神經(jīng)細胞膜上經(jīng)節(jié)苷脂受體和 synaptotamin 蛋白受體實現(xiàn)的。文獻調(diào)研顯示真正起識別和結(jié)用的是 HCc 的第 1080 至 1291 氨基酸這個區(qū)域（如下圖綠色部分）。圖中黑框部分為 HCc 和神經(jīng)細胞的神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合域的二級結(jié)構(gòu)，其中綠色的氨基

3圖 1.2 肉毒素結(jié)構(gòu)示意圖肉毒素和神經(jīng)細胞的識別是通過肉毒素重鏈的羧基端(HCc)和神經(jīng)細胞膜上神經(jīng)節(jié)苷脂受體和 synaptotamin 蛋白受體實現(xiàn)的。文獻調(diào)研顯示真正起識別和結(jié)作用的是 HCc 的第 1080 至 1291 氨基酸這個區(qū)域（如下圖綠色部分）。圖中黑框的部分為 HCc 和神經(jīng)細胞的神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合域的二級結(jié)構(gòu)，其中綠色的氨基是參與識別的氨基酸，也是我們要進行定點突變的位點。這些位點分別是：1）于 1266 位的色氨酸（W）取代其吲哚基；2）1267 位的酪氨酸（Y）取代其 苯環(huán)3）1253 位的組氨酸（H）取代其咪唑基；4）1203 位的谷氨酸(E)變成中性氨基或堿性氨基酸；5）1264 位的絲氨酸（S）消除羥基改變極性。通過這樣一系列的變，來確定 HCc 中的不同特性的殘基對肉毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的作用的提高程度，確肉毒素對神經(jīng)細胞親合力最強的結(jié)合結(jié)構(gòu)域[43-45]。

【參考文獻】

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本文編號：2729759