【摘要】：研究背景及目的:乳腺癌是影響人類健康的嚴重公共問題,鹽酸二甲雙胍是臨床治療糖尿病的一線藥物,臨床使用已達數(shù)十年。隨著科學研究水平的不斷提高和技術(shù)的發(fā)展,對鹽酸二甲雙胍的降血糖及其他的藥理活性也進行了較多研究,如心臟保護作用,血脂改善作用和可能的抗腫瘤作用。臨床前研究結(jié)果顯示鹽酸二甲雙胍可影響腫瘤的發(fā)病率和死亡率,由此,本課題研究鹽酸二甲雙胍抗乳腺癌的藥理活性,并對葡萄糖小分子對其抗腫瘤活性的影響進行了研究,該研究可推進鹽酸二甲雙胍治療或輔助治療乳腺癌在臨床上的應用。方法:(1)二甲雙胍對小鼠乳腺癌的作用及機制研究:40只昆明小鼠隨機分為生理鹽水組(CT)及鹽酸二甲雙胍組(MT),并接種4T1乳腺癌細胞構(gòu)建乳腺癌小鼠模型。MT組小鼠按200 mg/kg劑量每天給予鹽酸二甲雙胍溶液,CT組小鼠每天給予生理鹽水,實驗周期為14天,每天對小鼠進行一般狀況觀察,記錄小鼠體重及腫瘤體積,并采用代謝組學技術(shù)研究鹽酸二甲雙胍誘導乳腺癌小鼠血漿的代謝重編程。(2)二甲雙胍對乳腺癌MCF-7細胞的作用及機制研究:1采用MTT法及流式細胞術(shù)研究鹽酸二甲雙胍對乳腺癌細胞MCF-7的增殖抑制作用及其對細胞周期和凋亡的影響;并進一步研究葡萄糖小分子對鹽酸二甲雙胍抑制乳腺癌細胞增殖的影響,采用代謝組學技術(shù)研究正常環(huán)境下鹽酸二甲雙胍抑制乳腺癌細胞增殖的分子機制以及葡萄糖濃度的改變影響其作用的分子機制;2通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測MCF-7細胞中的通路相關(guān)蛋白,研究其在鹽酸二甲雙胍抗乳腺癌活性中的作用。(3)二甲雙胍抗乳腺癌作用的機制分析:應用生物信息學工具,篩選乳腺癌中差異表達的基因,結(jié)合鹽酸二甲雙胍體內(nèi)外抑制乳腺癌增殖的代謝組學研究結(jié)果,分析鹽酸二甲雙胍抗乳腺癌的作用機制。結(jié)果:(1)二甲雙胍對小鼠乳腺癌作用結(jié)果:生理鹽水組腫瘤體積由310.6±20.8mm~3增至411.3±40.8 mm~3,鹽酸二甲雙胍組腫瘤體積由373.5±22.3 mm~3減小至185.8±29.4 mm~3(P0.05)。分析荷乳腺癌小鼠血漿代謝組學結(jié)果:與對照組相比,主要的差異化合物為檸檬酸,谷氨酰胺,醛固酮,維生素B6等,這些差異化合物涉及三羧酸循環(huán)、谷氨酸和谷氨酰胺的代謝及類固醇激素生物合成等通路。(2)1 MTT實驗結(jié)果顯示:鹽酸二甲雙胍作用于MCF-7細胞24 h后,其IC_(50)值為30.70±1.21 mM;鹽酸二甲雙胍在系列濃度葡萄糖(5.0 mM、7.5 mM、10.0 mM、12.5 mM、15.0 mM)培養(yǎng)基中作用于MCF-7細胞24 h后,其IC_(50)值分別為21.94±0.68 mM、24.88±0.55 mM、30.70±1.21 mM、31.10±1.39 mM、93.39±5.01 mM;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示:二甲雙胍作用24 h后,MCF-7細胞凋亡率為(7.29±0.85)%,顯著高于對照組(P0.05),且培養(yǎng)基中葡萄糖濃度影響二甲雙胍誘導細胞的凋亡,凋亡率與葡萄糖濃度成反比。流式細胞術(shù)檢測細胞周期結(jié)果顯示:鹽酸二甲雙胍作用24 h后阻滯MCF-7細胞于G1期,分析培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對二甲雙胍誘導細胞周期阻滯的影響結(jié)果顯示:在葡萄糖濃度為10.0 mM時G1期的阻滯作用最為明顯。分析鹽酸二甲雙胍對MCF-7細胞增值抑制作用的代謝組學結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸二甲雙胍作用于MCF-7細胞24h后,檸檬酸,蘋果酸和谷氨酰胺的含量顯著性降低,表明MCF-7細胞中TCA循環(huán)和谷氨酸,谷氨酰胺代謝等能量代謝途徑受到調(diào)控。進一步研究葡萄糖濃度影響二甲雙胍抑制MCF-7細胞增殖的作用機制,發(fā)現(xiàn)低糖進一步增強了鹽酸二甲雙胍對TCA循環(huán)的調(diào)控作用。2 ELISA檢測MCF-7細胞中檸檬酸合酶的結(jié)果顯示:鹽酸二甲雙胍作用后MCF-7細胞中檸檬酸合酶含量降低,而低糖培養(yǎng)基中MCF-7細胞的檸檬酸合酶含量增多。(3)應用生物信息學工具篩選出乳腺癌中2336個差異表達的基因,結(jié)合鹽酸二甲雙胍作用于荷瘤小鼠和乳腺癌細胞MCF-7的代謝組學結(jié)果,發(fā)現(xiàn)鹽酸二甲雙胍可改變TCA循環(huán)及谷氨酸和谷氨酰胺的代謝,抑制乳腺癌細胞增殖。結(jié)論:(1)鹽酸二甲雙胍具有抗乳腺癌的活性;(2)鹽酸二甲雙胍抗乳腺癌作用的機制可能是通過調(diào)節(jié)TCA循環(huán)及谷氨酸和谷氨酰胺的代謝抑制乳腺癌的增殖,誘導細胞凋亡。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96
【圖文】：

圖 1.1 MT 組與 CT 組小鼠腫瘤體積。Fig. 1.1 Tumor volume of mice in the MT group and the CT group.小鼠血漿樣品代謝組學結(jié)果 小鼠血漿樣品的總離子流圖為了研究鹽酸二甲雙胍對荷瘤小鼠代謝的影響，本實驗采用 UPLC-M對各組的血漿樣品進行數(shù)據(jù)采集，由于血漿樣品中的代謝物成分復雜集更多的代謝物的信息，本課題采用 T3 和 C18 兩種色譜柱，在兩種離正離子模式 ESI+，負離子模式 ESI㧟）下進行樣本分析，圖 1.2 為各個總離子流圖。結(jié)果顯示，每種模式下，各色譜法均呈現(xiàn)了較好的分離

1.2 CT 組和 MT 組荷瘤小鼠總離子流圖。（A 為 CT 組所得總離子流圖，B 為 MT 得總離子流圖。）Fig.1.2 Total ion chromatograms of tumor-bearing mice in CT group and MT group.（Aobtained from the CT group, B is obtained from the MT group.）.2 儀器的穩(wěn)定性在整個液質(zhì)分析過程中，為了所獲數(shù)據(jù)的可靠可信，需考察儀器的穩(wěn)定課題從以下兩方面進行考察：（1）在整個序列中每隔 5 個樣本加入一針 QC 樣品，通過查看每個 Q中各個峰的出峰時間來查看儀器的穩(wěn)定性以及所得數(shù)據(jù)是否可信。在本中，分別在不同采集模式下隨機選出 5 個離子進行檢驗，通過計算各個每個 QC 中的出峰時間及峰面積進而得到該離子的出峰時間 RSD 及峰D，以此評價儀器穩(wěn)定性，進而得知數(shù)據(jù)是否可信。表 1.4 和表 1.5 分別為 ESI-離子模式下所檢驗離子的出峰時間 RSD 和峰面積 RSD。

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本文編號：2723018