發(fā)布時間：2020-06-04 20:01

【摘要】：熱休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)是ATP依賴的分子伴侶蛋白,參與客戶蛋白的構象成熟和功能穩(wěn)定,防止蛋白經由泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解。在Hsp90調控的客戶蛋白中,有很多是致癌信號通路中的原癌基因表達蛋白或重要的信號轉導因子,參與調控腫瘤細胞的基本特征,與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關系密切。因此,針對Hsp90單一靶點的單一用藥抑制其伴侶功能,導致多種客戶蛋白的降解,多重阻斷腫瘤信號通路,最終摧毀腫瘤賴以生存的整個信號通路網絡,能夠同時拮抗多個甚至全部腫瘤細胞的標志性特征,有效減少藥物耐受。在充分調研文獻的基礎上,針對Hsp90蛋白N端ATP結合域的三維結構及Hsp90與其抑制劑的作用模式進行了深入的研究。采用基于片段的藥物設計(FBDD)方法,選取根赤殼霉素的5-氯-2,4-二羥基苯甲酸片段,以四氫異喹啉-3-羧酸為骨架,設計、合成了(S)-Tic(A1-13)和(R)-Tic(B1-13)兩個系列的化合物�？鼓[瘤細胞增殖活性實驗揭示了目標化合物的構效關系,含手性(R)-Tic骨架的分子活性更高。CETSA靶向Hsp90α活性篩選結果印證了抗腫瘤細胞增殖活性實驗結果,(R)-Tic骨架的B系列化合物靶向Hsp90α,而且其芳香側鏈提高化合物的活性。兩輪活性篩選結果表明,含(R)-Tic骨架的化合物B7呈現最強的抗腫瘤細胞增殖活性和最佳的靶向Hsp90α活性。CETSA“熔化曲線”和ITDRFCETSA(等溫劑量反應)曲線證實化合物B7在胞內直接與Hsp90α結合。此外,如同公認的Hsp90抑制劑GA,化合物B7同樣能夠引起Hsp90客戶蛋白水平下調和Hsp70水平上調,進一步證實了化合物B7靶向Hsp90。分子模擬結果闡明了化合物B7活性最佳的原因,(R)-Tic骨架維持小分子獨特的活性構象,芐胺側鏈深入誘導疏水口袋,與氨基酸殘基Phe138形成π-π相互作用。所有的這些特性保證化合物B7是一個可靠的Hsp90抑制劑的先導化合物。為了提高先導化合物B7芐胺側鏈與疏水口袋的空間適配,我們設計、合成了 C系列側鏈苯環(huán)取代衍生物和D系列側鏈芳雜環(huán)衍生物�；钚院Y選實驗顯示芳環(huán)取代基的種類、個數、位置顯著影響化合物的活性。芳環(huán)對位單取代的氫鍵受體取代基有利于提高化合物活性,其中含對位吡啶基的化合物D4活性最佳。CETSA“熔化曲線”和ITDRFCETSA曲線證實化合物D4在胞內直接與Hsp90α結合。此外,同GA 一樣,化合物D4同樣能夠引起Hsp90客戶蛋白水平下調和Hsp70水平上調,進一步證實了化合物D4靶向Hsp90。分子模擬結果闡明了化合物D4活性最佳的原因,5-氯-2,4-二羥基苯甲�；闻cHsp90 口袋底部結合,(R)-Tic骨架維持D4獨特的活性構象,酰胺側鏈深入誘導疏水口袋,吡啶環(huán)不僅與氨基酸殘基Phe]38形成π-π相互作用,而且與氨基酸殘基Tyr139形成氫鍵結合�？鼓[瘤細胞增殖活性普篩實驗表明化合物D4具有廣譜的抗腫瘤細胞增殖活性,并且這種活性呈現時間與濃度依賴性。在MDA-MB-453細胞中,D4誘導細胞G0/G1期阻滯。Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術和western blot實驗證實D4誘導MDA-MB-453細胞凋亡。在NF-κB信號途徑中IKK是關鍵激酶。Hsp90抑制劑D4不僅降低IKK的蛋白水平,而且還能通過磷酸化Hsp27降低IKK的生物活性。通過對IKK的調控,D4成功地抑制TNF-α誘導的NF-κB的活化。綜上所述,化合物D4是一個可靠的Hsp90抑制劑,具有進一步探索其生物作用機制的價值�；衔顳4的進一步結構優(yōu)化集中在四氫異喹啉片段�；衔顳4的分子模擬結果顯示四氫異喹啉的苯環(huán)臨近Lys58并且朝向溶劑暴露區(qū),就此兩種優(yōu)化策略產生E系列化合物和F系列化合物。期望與Lys58產生氫鍵作用提高靶向活性,同時優(yōu)化物理化學性質和藥代動力學行為,提高用藥安全性。目前,這兩個系列化合物的合成及活性篩選工作已完成,抗腫瘤機制研究正在進行中。綜上,本課題基于Hsp90 N端ATP結合域的三維結構及抑制劑與Hsp90的作用模式,綜合應用藥物化學、化學生物學、計算機化學等前沿學科,合理設計、合成了系列的四氫異喹啉-3-羧酸類化合物。引入細胞熱轉變分析(CETSA)檢驗化合物的靶向性,并對代表性化合物進行了深入的機制研究。本課題的研究內容拓展了 Hsp90抑制劑的結構類型,為下一代抑制劑的研發(fā)提供了借鑒意義。
【圖文】：

圖１．１８候選藥物ＮＹＰ－ＨＳＰ９９０的研發(fā)示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１８邋Ｒｅｓｅａｒｃｈ邋ａｎｄ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ邋ｓｋｅｔｃｈ邋ｏｆ邋ｃａｎｄｉｄａｔｅ邋ｄｒｕｇ邋ＮＶＰ－ＨＳＰ９９０逡逑（３）苯甲酷胺類Ｈｓｐ９０抑制劑逡逑小分子ＳＮＸ－５４２２起源于高通量篩選得到的先導化合物６邋［１９３］�；衔铮杜c逡逑Ｈｓｐ９０有中等的親和力（Ｋａ邋＝邋３．７ｐＭ），，細胞毒性差（ＩＣ５Ｑ＞５０＾Ｍ）。Ｘ射線晶逡逑體衍射發(fā)現化合物６的苯甲酰胺結構與氨基酸殘基Ａｓｐ９３、Ｔｈｒｌ８４形成氫鍵作逡逑用，吲哚酮片段驅使Ｌｅｕｌ０７移位，誘導產生疏水口袋，這與ＰＵ系列化合物相逡逑同，并且吲哚酮的羰基氫鍵結合Ｔｙｒｌ３９（Ｆｉｇｕｒｅｌ．ｌ９Ｂ）。在化合物６共晶結構的逡逑指導下，首先對苯環(huán)２位進行惻鏈修飾。檢測結果表明以ＮＨ作為鄰位惻鏈ｌｉｎｋｅｒ逡逑能夠與酰胺羰基形成分子內氫鍵，利于活性提高。烷基和芳基取代與Ｍｅｔ９８存在逡逑疏水相互作用。此外，化合物７的含氧惻鏈還與Ｌｙｓ５８形成氫鍵作用。吲哚酮２逡逑位甲基移位至３位可增強化合物活性。在化合物８的分子結構中，對胺基苯氧結逡逑

圖...目由招乍臼月
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R91;R96


本文編號：2696904