【摘要】：目的:本文選取人白血病細(xì)胞K562(CML)和HL60(AML)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?探討了他汀類藥物阿托伐他汀(Atorvastatin,AT)的抗白血病活性及分子作用機(jī)制,為拓展AT的抗白血病新用途提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:1.利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AT對(duì)K562、HL60和健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的增殖抑制作用。2.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AT對(duì)K562和HL60細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)以及線粒體膜電位的影響。3.利用細(xì)胞免疫熒光法分別檢測(cè)不同濃度AT以及AT與甲羥戊酸(Mevalonic acid,MVA)共同作用對(duì)K562和HL60細(xì)胞內(nèi)Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)表達(dá)及其核轉(zhuǎn)位效應(yīng)的影響。4.利用Western-blot檢測(cè)不同濃度AT對(duì)K562和HL60細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、p27、p Rb、cyclin B1、cdc2等因子表達(dá)或磷酸化水平的影響,凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-9、caspase-3、PARP、cytochrome c(cyt c)等因子表達(dá)水平的影響,細(xì)胞核內(nèi)YAP以及細(xì)胞質(zhì)中p-YAP水平的影響。5.利用Western-blot分別檢測(cè)AT單獨(dú)作用以及AT分別與MVA、香葉基香葉基焦磷酸鹽(Geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)、法尼基焦磷酸鹽(Farnesyl pyrophosphate,FPP)共同作用對(duì)K562和HL60細(xì)胞核內(nèi)YAP表達(dá)水平、細(xì)胞質(zhì)中p-YAP磷酸化水平的影響。結(jié)果:1.AT具有抑制人白血病細(xì)胞增殖活性。MTT結(jié)果顯示,AT呈劑量依賴性方式抑制K562和HL60細(xì)胞增殖,藥物IC50值分別為10.55μM和10.26μM;AT對(duì)人PBMCs的細(xì)胞毒性較低,IC50值為102.70μM。2.AT具有誘導(dǎo)K562和HL60細(xì)胞周期阻滯作用。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析以及Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,AT阻滯K562細(xì)胞周期G2/M期,引起細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin B1、cdc2降表達(dá);AT阻滯HL60細(xì)胞周期G0/G1期,引起細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p27升表達(dá),cyclin D1、p-p Rb降表達(dá)。3.AT具有誘導(dǎo)K562和HL60細(xì)胞凋亡作用,該活性與ROS介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑密切相關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)以及Western-blot分析結(jié)果顯示,20μM AT處理K562和HL60細(xì)胞組的凋亡細(xì)胞數(shù)目(34.67%和39.16%)較對(duì)照組(6.20%和8.17%)顯著增加;AT引起促凋亡蛋白Bax升表達(dá),抗凋亡蛋白Bcl-2降表達(dá),cyt c釋放到胞漿,進(jìn)而促進(jìn)caspase-9、caspase-3、PARP裂解。此外,AT誘導(dǎo)K562和HL60細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加,線粒體膜電位水平降低。4.AT具有抑制K562和HL60細(xì)胞內(nèi)YAP核轉(zhuǎn)位的作用。細(xì)胞免疫熒光以及Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度AT處理后,K562和HL60細(xì)胞中YAP的核轉(zhuǎn)位效應(yīng)顯著降低,表現(xiàn)為給藥后細(xì)胞核內(nèi)YAP降低,而細(xì)胞質(zhì)中p-YAP升高。5.AT對(duì)YAP核轉(zhuǎn)位效應(yīng)的抑制作用依賴于MVA途徑。細(xì)胞免疫熒光以及Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,外源性MVA、GGPP的加入緩解了AT引起的YAP核轉(zhuǎn)位抑制效應(yīng);此外,FPP的加入?yún)s無(wú)此影響。結(jié)論:1.AT體外抗白血病作用主要體現(xiàn)于對(duì)K562和HL60細(xì)胞的增殖抑制、周期阻滯以及誘導(dǎo)凋亡活性。2.AT對(duì)YAP核轉(zhuǎn)位的抑制作用依賴于MVA/YAP途徑,通過(guò)抑制MVA途徑中間代謝產(chǎn)物的合成進(jìn)而抑制YAP由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位效應(yīng)。
【圖文】：

觀察拍照。學(xué)分析方法據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù) 3 ad Prism 5.0 軟件進(jìn)行 t 檢驗(yàn)，p < 0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異**p < 0.001）伐他汀（AT）對(duì) K562、HL60 細(xì)胞增殖活性的影響同濃度的阿托伐他�。ˋT）處理K562、HL60細(xì)胞以及正采用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果如圖型中，阿托伐他�。ˋT）以劑量依賴性方式抑制 K562 GraphPad Prism 5.0 計(jì)算其 IC50值分別為 10.55 μM、10伐他�。ˋT）對(duì)正常細(xì)胞 PBMC 的增殖抑制作用較弱以上結(jié)果表明，阿托伐他�。ˋT）能夠抑制 K562、H時(shí)對(duì)正常細(xì)胞 PBMC 的毒性較低。

阿托伐他�。ˋT）對(duì)細(xì)胞周期分布以及周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2696454