【摘要】：【研究背景】雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類強效免疫抑制劑,具有抗真菌?抑制腫瘤生長?特異性抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,mTOR)蛋白活性的作用?異位骨化(Heterotopic ossification,HO)是指在正常骨骼系統(tǒng)之外(常見如肌肉?跟腱?關(guān)節(jié)囊等軟組織)出現(xiàn)異常的真性骨組織?異位骨化目前主要分為兩種:一種是遺傳性HO,發(fā)病率低但是癥狀嚴重且死亡率高,包括由ACVR1發(fā)生激活性突變的進行性肌肉骨化癥(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva,FOP)以及編碼G蛋白a亞基的GNAS基因發(fā)生失活突變引起的進行性骨發(fā)育異常(Progressive Osseous Heteroplasia,POH);另一種是獲得性HO,相對于遺傳性HO來說,癥狀較輕,死亡率低,但是發(fā)病率高,患者癥狀的輕重往往與創(chuàng)傷的嚴重程度成正比,且與創(chuàng)傷部位以及創(chuàng)傷來源密切相關(guān),常見的創(chuàng)傷來源包括如槍傷?爆炸等的戰(zhàn)斗中損傷,如髖關(guān)節(jié)置換術(shù)等手術(shù)引起的損傷,脊髓神經(jīng)系統(tǒng)受損,較嚴重的大面積燒傷等?相對而言,國際上對于遺傳性HO的致病機理研究得較為廣泛,一些針對潛在的致病因素的藥物逐漸涌現(xiàn),如維甲酸受體γ激動劑帕拉羅汀,被廣泛使于FOP的患者,且療效較好?但是縱觀目前對HO研究的大環(huán)境,針對性的研究創(chuàng)傷性HO的文獻還是相對較少的,雖然學者們做過一些相關(guān)的信號通路的研究,但是目前還不能完全理順創(chuàng)傷性HO的致病機制的因果關(guān)系和整個的病因鏈,所以對于創(chuàng)傷性HO的治療方法相對來說比較匱乏?因此,我們課題組主要致力于研究創(chuàng)傷性HO的致病機制與治療方法?創(chuàng)傷性HO的治療方法已經(jīng)漸漸成為熱點,比如說手術(shù)切除,脈沖低強度電磁場,皮質(zhì)類固醇類?NSAIDS藥物、二磷酸鹽類治療等,但是這些治療措施結(jié)果不穩(wěn)定,副作用較大,機理也不太明確。故此,我們希望在這方面能夠有所突破。我們選擇mTOR蛋白特異性抑制劑RAPA作為研究的重心?RAPA所具備的強效免疫抑制作用已經(jīng)在臨床上被用于多種疾病的治療,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡?中風,肺癌等?另外,RAPA還具有調(diào)節(jié)細胞自噬,抑制異體移植可能會出現(xiàn)的免疫排斥反應?RAPA用于HO的作用是近幾年才開始被發(fā)現(xiàn)的?現(xiàn)在還不知RAPA是否還參與調(diào)節(jié)其他信號通路來抑制HO的發(fā)生和發(fā)展?作用機理到底是什么?【研究方法】1.建立AHO模型:實驗開始之前,選取數(shù)量(各5只)?性別?年齡(成年,一般在3~4周)?窩別?體重?活動情況等因素相匹配的NSE-BMP4實驗小鼠,分為對照組和實驗組?在實驗第一天,所有小鼠左腿肌肉注射一次等量的的(100ng/100μl)的心臟毒素(cardiotoxin,CTX)作為損傷條件,以損傷1周?2周?4周的組織作為創(chuàng)傷性HO的早?中?后期階段來觀察,以此創(chuàng)建創(chuàng)傷性HO的小鼠模型?2.給藥:實驗組小鼠在用CTX損傷后,腹腔注射已被溶解和稀釋的RAPA(100μg/100μl),每隔一天給藥一次,對照組給予溶劑,給藥劑量?方法?時間等情況與實驗組小鼠相同?3.X光:給藥結(jié)束后,將實驗鼠在麻醉的情況下于小動物成像儀(型號FX PRO)里進行X光拍攝,觀察損傷部位異位骨生長情況,比較實驗組和對照組的差異?4.對小鼠進行眼球取血:于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科進行WBC數(shù)目和分型檢測(日本希森美康XS-800i五分類血細胞分析儀)?5.免疫熒光檢測:取HO不同時相的小鼠損傷部位組織,先制作成冰凍切片,然后選取特異的靶蛋白的抗體以及相應的熒光二抗進行免疫熒光染色?6.組織Western Blot:檢測實驗組和對照組小鼠的損傷部位組織中靶蛋白如Hif1a的表達差異?【研究結(jié)果】1.影像學結(jié)果顯示:與對照組相比,給予RAPA的實驗組經(jīng)損傷后出現(xiàn)的異位骨明顯減少,并在一定的劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性?2.外周血白細胞計數(shù)和分型檢測結(jié)果顯示:相比較于對照組,給予RAPA的實驗組外周血WBC明顯降低,且差異具有統(tǒng)計學意義?3.免疫熒光結(jié)果顯示:RAPA可以降低損傷部位P-mTOR的表達?4.RAPA可以通過抑制Hif1a的表達來抑制HO?5.氧化應激伴隨著異常免疫反應參與HO早期的纖維增生階段的進展?6.RAPA可以降低HO損傷區(qū)域中血管的形成?【結(jié)論】氧化應激伴隨著異常免疫反應,參與HO的早期階段,而雷帕霉素可以通過降低mTOR蛋白的表達,緩解低氧環(huán)境,抑制mTOR信號和氧化應激來抑制HO的發(fā)生。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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本文編號：2688957