【摘要】：Toll樣受體(Toll Like Receptors,TLRs)是人類免疫系統(tǒng)的重要模式識(shí)別受體家族,可識(shí)別相關(guān)病原體特有分子模式并激活先天性免疫反應(yīng)。作為單鏈RNA(Single Stranded RNA,ssRNA)受體,hTLR8(Human Toll Like Receptor 8)與腫瘤、微生物感染以及炎性疾病密切相關(guān)。因此,hTLR8激動(dòng)劑分子識(shí)別與作用機(jī)理研究對(duì)免疫調(diào)控類藥物研發(fā)具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。為探尋影響hTLR8激動(dòng)劑活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)/性質(zhì)特征,論文首先采用顯露化學(xué)模式(Emerging Chemical Pattern,ECP)、系統(tǒng)聚類分析法(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)以及分子對(duì)接(Molecular docking)方法,對(duì)已有hTLR8激動(dòng)劑進(jìn)行了分子識(shí)別研究。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)(Molecular Dynamics,MD)和靶向動(dòng)力學(xué)(Targeted Molecular Dynamics,TMD)模擬方法,對(duì)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的hTLR8構(gòu)象變化與信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程進(jìn)行了探索性研究,研究結(jié)果可為hTLR8激動(dòng)劑藥物研發(fā)及作用機(jī)理提供重要的理論參考依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:(1)采用ECP模式識(shí)別方法,對(duì)97個(gè)hTLR8激動(dòng)劑和114個(gè)非激動(dòng)劑樣本建立了分子識(shí)別模型,研究結(jié)果顯示:僅采用6個(gè)描述子的最優(yōu)ECP模型對(duì)132個(gè)訓(xùn)練集樣本、79個(gè)驗(yàn)證集樣本和75個(gè)外部測(cè)試集樣本的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性分別為83.3%、81.0%和80.0%;當(dāng)將最優(yōu)ECP模型與Surflex分子對(duì)接模型聯(lián)用時(shí),組合模型(ECP-Surflex)對(duì)外部測(cè)試集的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性分別為94.2%、97.2%和87.5%。研究結(jié)果顯示:與非激動(dòng)劑相比,激動(dòng)劑具有明顯的氫鍵和親疏水性不對(duì)稱分布特征。(2)采用ECP方法,對(duì)97個(gè)hTLR8激動(dòng)劑和29個(gè)拮抗劑建立了識(shí)別模型。研究結(jié)果顯示:采用3個(gè)描述子的最優(yōu)模型對(duì)76個(gè)訓(xùn)練集樣本和50個(gè)驗(yàn)證集樣本的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性分別為93.4%和92.2%。研究結(jié)果顯示:激動(dòng)劑與hTLR8具有更強(qiáng)氫鍵相互作用特征,而拮抗劑與hTLR8則以疏水相互作用為主。(3)經(jīng)序列比對(duì)和缺失殘基補(bǔ)齊,對(duì)空載狀態(tài)下hTLR8受體進(jìn)行三維模建和動(dòng)力學(xué)優(yōu)化,所得最優(yōu)模型在結(jié)構(gòu)和能量上均合理可靠。基于該最優(yōu)模型,采用Surflex-dock分子對(duì)接和動(dòng)力學(xué)方法構(gòu)建了激動(dòng)劑CL097、CL075和R848與hTLR8復(fù)合物的過(guò)渡態(tài)模型。研究結(jié)果顯示:CL075和R848與hTLR8形成了相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)合物過(guò)渡態(tài)模型。(4)以CL097、CL075、R848激動(dòng)劑與hTLR8復(fù)合物的過(guò)渡態(tài)模型為起始構(gòu)象,激動(dòng)劑與hTLR8天然結(jié)合構(gòu)象為目標(biāo)構(gòu)象,采用靶向分子動(dòng)力學(xué)模擬方法對(duì)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的hTLR8構(gòu)象變化與二聚化過(guò)程進(jìn)行了探索性研究。通過(guò)對(duì)TMD模擬過(guò)程中殘基RMSF變化以及相鄰LRR間氫鍵相互作用分析,推測(cè)由激動(dòng)劑誘導(dǎo)的構(gòu)象變化經(jīng)LRR外層殘基,尤其是帶電氨基酸殘基介導(dǎo)的氫鍵相互作用由近至遠(yuǎn)向末端傳導(dǎo),最終引發(fā)了hTLR8單體的二聚化過(guò)程。
【圖文】：

重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文進(jìn)行多序列比對(duì)分析(NCBI-BLAST)，結(jié)果顯示：TLR 受體家族胞外區(qū)較差，僅有 37 處相同殘基和 79 處相似殘基，一致性和相似性序列分 9.1%；TLR7、TLR8 和 TLR9 胞外區(qū)序列具有更高的同源性，一致性列分別為 7.1%和 15.2%。 1.1 為 TLR1 到 TLR10 胞外區(qū)序列進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果。TLRs 按序列同源兩大類，一類是跨細(xì)胞膜受體蛋白(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR)，另一類則是跨溶酶體膜受體蛋白(TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)；跨蛋白根據(jù)所識(shí)別的底物類型又可分為三類，分別是以脂蛋白為底TLR2、TLR6；以細(xì)菌鞭毛蛋白為底物的 TLR5 和以細(xì)菌壁脂多糖為4；跨溶酶體膜受體蛋根據(jù)識(shí)別的底物可分為兩類，分別是以病毒單、識(shí)別底物的 TLR7/8 和以病毒 DNA 為識(shí)別底物的 TLR9。

圖 1.2 Toll 樣受體的底物識(shí)別及其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[39]Figure 1.2 PAMPs of TLRs and the TLR-mediated immune response1.3 hTLR8 的結(jié)構(gòu)與功能人源 TLR8(hTLR8)為細(xì)胞內(nèi)溶酶體跨膜蛋白，同樣由胞外區(qū)，跨膜區(qū)，胞內(nèi)區(qū)組成。具有底物識(shí)別功能的 hTLR8 胞外區(qū)是由兩條單體組成的同源二聚體結(jié)構(gòu)，每條單體具有 800 多個(gè)氨基酸殘基。每條 hTLR8 單體具有 26 個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列區(qū)域22。hTLR8 胞外區(qū)具有兩類特異性底物結(jié)合位點(diǎn)，，可識(shí)別 ssRNA 的降解產(chǎn)物，即去磷酸化尿嘧啶核糖核苷(Nonphosphorylated Uridine Nucleoside, NUN)和短鏈寡聚核糖核苷酸(Short Oligonucleotides)[40, 41]。圖1.3為hTLR8胞外區(qū)的三維結(jié)構(gòu)示意圖。圖1.3a為空載狀態(tài)構(gòu)象(Apo State)，可以看出每個(gè)單體分別含有 6 個(gè)短的 Loop 區(qū)域(LRR2，LRR5，LRR8，LRR11，LRR18，LRR20)以及一個(gè)長(zhǎng) Z-Loop 區(qū)域(位于 LRR14、15 之間，約由 40 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成)。圖 1.3b 為配體結(jié)合構(gòu)象(Holo State)，可以看到位于二聚體結(jié)合界面中的尿苷結(jié)合位點(diǎn)以及與位于馬蹄結(jié)構(gòu)凹面上的短鏈寡聚核糖核苷酸 UG 結(jié)合的
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2680830