【摘要】：背景:空氣中的顆粒物(Particulate matter,PM)是大氣污染影響人類健康的主要成分,其毒性已被大量研究證實。其中粒徑較小的超細(xì)顆粒更容易在肺中聚集沉積,對人類健康的影響嚴(yán)重。超細(xì)顆粒的表面積與體積比大,具有強(qiáng)大的吸附能力,可吸附大量有毒污染物,共同造成人體細(xì)胞和器官損傷。但是,二者可能產(chǎn)生的交互作用及介導(dǎo)其聯(lián)合作用的機(jī)制尚不清楚。因此,本研究旨在探究一種典型的大氣超細(xì)顆粒物納米炭黑顆粒(Carbon black nanoparticles,CBNPs)和一種具有代表性的空氣污染物鉛離子(Pb~(2+))的聯(lián)合作用和機(jī)制。CBNPs是研究空氣顆粒物毒性的良好模型,空氣中的CBNPs主要來自于燃燒源不完全燃燒產(chǎn)生的煙灰。由于其粒徑較小,可深入至肺泡,直接影響肺功能。Pb~(2+)作為一種典型的空氣污染物,來源于人為活動,如燃料燃燒,工業(yè)生產(chǎn)和垃圾焚燒排放等。二者經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺內(nèi),可在肺部沉積,導(dǎo)致肺部疾病。肺泡巨噬細(xì)胞位于肺泡腔及微小氣道內(nèi),是肺組織內(nèi)重要的常駐細(xì)胞和防御細(xì)胞,在肺部疾病的發(fā)病過程中,巨噬細(xì)胞受損是常見的重要機(jī)制。先前的研究發(fā)現(xiàn)CBNPs或Pb~(2+)可誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞損傷和凋亡,但目前尚無聯(lián)合CBNPs和Pb~(2+)應(yīng)用對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的作用及機(jī)制的研究報道。目的:本實驗主要研究CBNPs和Pb~(2+)聯(lián)合誘導(dǎo)NR8383細(xì)胞凋亡的作用和可能的機(jī)理,旨揭示CBNPs和Pb~(2+)聯(lián)合促細(xì)胞凋亡作用機(jī)制,為預(yù)防和治療PM相關(guān)肺疾病提供理論依據(jù)。方法:1.吸附鉛離子的納米炭黑顆粒(CBNPs-Pb~(2+))制備及表征:采用DLS,TEM,SEM以及多點BET分析,對CBNPs及CBNPs-Pb~(2+)進(jìn)行表征,使用ICP-OES量化CBNPs對Pb~(2+)的吸附情況,評估吸附顆粒的穩(wěn)定性。2.CBNPs和Pb~(2+)聯(lián)合促凋亡作用研究:將大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383)分別或共同暴露于一定濃度的CBNPs和Pb~(2+)中24h,分析各種細(xì)胞參數(shù)。Annexin V-FITC/PI染色,DAPI染色以及Western blot檢測細(xì)胞凋亡水平,采用DCFDA檢測活性氧(ROS)產(chǎn)生,JC-1用于檢測線粒體膜電位的變化。3.聯(lián)合作用機(jī)制研究:采用透射電子顯微鏡,Western blot,mRFP-GFP-LC3腺病毒檢測細(xì)胞自噬水平以及自噬流,采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素和自噬溶酶體途徑抑制劑氯喹進(jìn)一步分析自噬溶酶體途徑在CBNPs-Pb~(2+)誘導(dǎo)NR8383細(xì)胞凋亡中的作用。結(jié)果:1.成功制備了吸附鉛離子的納米炭黑顆粒(CBNPs-Pb~(2+)),通過對粒子表征分析發(fā)現(xiàn),CBNPs可以穩(wěn)定吸附Pb~(2+),且吸附Pb~(2+)之后,其物理性質(zhì)發(fā)生改變。動態(tài)光散射結(jié)果顯示,吸附后的納米顆粒形成的團(tuán)簇平均粒徑減小,并能在超聲處理后一段時間內(nèi)保持分散狀態(tài),這使其更容易被細(xì)胞吞噬,透射電子顯微鏡證實了這一現(xiàn)象;2.CBNPs-Pb~(2+)顯著增加NR8383細(xì)胞凋亡水平;3.CBNPs-Pb~(2+)顯著增加NR8383細(xì)胞中ROS的量,降低NR8383細(xì)胞的線粒體膜電位,導(dǎo)致線粒體功能障礙,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;4.CBNPs-Pb~(2+)激活NR8383細(xì)胞凋亡蛋白Caspase 3、Caspase 9,增加促凋亡蛋白Bax表達(dá),降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),顯著降低Bcl-2/Bax比值;5.CBNPs-Pb~(2+)阻斷NR8383細(xì)胞自噬流,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬體累積和細(xì)胞溶酶體功能障礙;6.自噬溶酶體途徑抑制劑氯喹進(jìn)一步加重CBNPs-Pb~(2+)所抑制的細(xì)胞自噬流,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素則能逆轉(zhuǎn)上述作用。結(jié)論:在這項研究中,我們使用CBNPs和Pb~(2+)為模型材料研究其對NR8383肺泡巨噬細(xì)胞的聯(lián)合毒性作用及機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn),CBNPs可以均勻且穩(wěn)定地吸附Pb~(2+),吸附后的納米顆粒物理性質(zhì)發(fā)生改變;CBNPs-Pb~(2+)誘導(dǎo)細(xì)胞過度氧化應(yīng)激及線粒體損傷,通過導(dǎo)致NR8383細(xì)胞溶酶體功能障礙和阻斷細(xì)胞自噬流,顯著增強(qiáng)細(xì)胞凋亡水平;CBNPs-Pb~(2+)可以通過自噬溶酶體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們的研究結(jié)果為理解環(huán)境微粒的毒性作用和致肺疾病的病理機(jī)制提供了新的見解,還可能為預(yù)防和治療空氣污染相關(guān)肺疾病提供實驗基礎(chǔ)。
【圖文】：

原生粒徑為 25nm，BET 比表面積為 100m2/g。由于納米粒子的物理性質(zhì)可影響其生物學(xué)及毒理學(xué)反應(yīng)，因此這些性質(zhì)的表征在其毒性評估中是很重要的[100]。在本部分研究中，我們采用 ICP-OES、DLS、TEM、SEM 以及多點 BET 分析，量化了 CBNPs 對 Pb2+的吸附并分別對 CBNPs 和 CBNPs-Pb2+進(jìn)行了表征。3.1.1 CBNPs 對 Pb2+的吸附情況按照上述方法制備 CBNPs-Pb2+后，使用能譜儀對粒子進(jìn)行元素定性分析，可發(fā)現(xiàn)CBNPs除去基本成分C元素外，，還存在少量的S元素與O元素。對CBNPs及 CBNPs-Pb2+分別進(jìn)行 mapping 分析，確定元素的面分布和線分布，可以較直觀地觀察到 Pb 元素均勻分散在粒子表面，說明鉛離子可以穩(wěn)定且均勻吸附于CBNPs。此結(jié)果能初步證實金屬鉛離子穩(wěn)定吸附于 CBNPs 上，所構(gòu)建納米粒子吸附金屬離子模型可以用于后續(xù)實驗。如圖 3.1 所示。

圖 3.2 CBNPs 及 CBNPs-Pb2+的電鏡圖CBNPs 和 CBNPs-Pb2+的透射電鏡圖像；（c，d） CBNPs 和 比例尺為 500nm動態(tài)光散射測量 DMEM-F12 中 CBNP，CBNPs-Pb2+的徑和ζ電位le Hydrodynamic size(nm) zeta-potentis 671.2±9.96 -30.5±3.b2+452.6±22 -34.8±0.7
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R99

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