【摘要】：隨著我國老齡化人口的增加,骨質疏松患者數目也在逐年增加。目前,多數己上市的抗骨質疏松藥物在發(fā)揮療效的同時仍存在不少副作用,尋找更加安全有效的抗骨質疏松藥物的需求尤為迫切。骨質疏松癥是一種骨重建異常導致的代謝性骨病,其中成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收之間的失衡是引起骨量丟失和骨結構改變的主要原因。因此,促進成骨細胞分化和/或抑制破骨細胞分化是治療骨質疏松癥的基本策略。RUNX2是調節(jié)成骨細胞分化的關鍵性轉錄因子,也是多條參與調節(jié)成骨細胞分化和骨形成的信號通路的匯聚點。RUNX2轉錄激活劑可能具有潛在的促進成骨細胞分化和骨形成的效應。NF-κB則是誘導破骨細胞分化的最重要的轉錄因子,抑制該因子的活性可抑制破骨細胞形成。因此,本課題擬分別利用反映RUNX2轉錄活性和反映NF-κB轉錄活性的細胞篩選模型,對小分子化合物庫和天然產物庫進行篩選,以期發(fā)現可促進成骨分化和/或抑制破骨分化的候選陽性化合物,并對其進行體內外抗骨質疏松活性評價和作用機制研究。為了實現這一目標,本研究分為兩個部分:一、基于RUNX2轉錄活性的高通量篩選與化合物T63的抗骨質疏松作用機制研究研究目的:利用基于RUNX2轉錄活性的細胞篩選模型,完成對小分子化合物庫的高通量篩選,并對活性最優(yōu)的目標化合物T63進行體內外抗骨質疏松的藥效學評價和作用機制研究。研究方法:利用熒光素報告基因系統,檢測待測化合物對RUNX2轉錄活性的影響。以多能間充質干細胞樣成纖維細胞C3H10T1/2和小鼠前體成骨細胞MC3T3-E1誘導分化的成骨細胞作為主要研究對象,采用MTT法、p-NPP法、茜素紅染色和PCR等方法,分別研究候選化合物T63對成骨細胞增殖、堿性磷酸酶(ALPL)活性、礦化結節(jié)形成和成骨細胞分化相關基因表達的影響,結合Western blot、ChIP和RNAi等技術考察T63對成骨細胞分化相關信號通路的影響。利用流式細胞術和雙熒光素報告基因系統分析T63對成骨前體細胞中ROS水平以及雌激素應答元件ERE活性的影響。油紅染色和實時定量PCR法檢測T63對間充質干細胞向脂肪分化的影響。采用TRAP染色、F-actin染色、PCR和Western blot等方法,分別考察在成骨細胞-破骨細胞共培養(yǎng)體系以及RANKL誘導的破骨細胞模型中,T63對破骨細胞的形成、細胞骨架融合以及破骨分化相關基因表達和信號通路的影響。體內采用卵巢去勢聯合地塞米松建立的骨質疏松大鼠模型,考察T63對大鼠骨密度、骨體積分數、血清生物標記物等的影響。實驗結果:本研究通過對小分子化合物庫中20760個化合物進行篩選,發(fā)現候選化合物T63可顯著上調小鼠成骨細胞模型中RUNX2的轉錄活性。進一步研究表明,T63在不影響細胞增殖的情況下,能顯著上調小鼠成骨細胞ALPL的活性、礦化結節(jié)的數目以及成骨分化相關基因Alpl、Bglap、Spp1、Runx2和Bmp2mRNA的表達。T63誘導小鼠成骨細胞分化的作用在人成骨細胞MG63和hFOB1.19中也得到了驗證。此外,該化合物也能抑制C3H10T1/2細胞向脂肪細胞分化過程中脂滴的形成和相關基因Pparγ2,Srebf1和Fabp4的表達。T63能上調RUNX2基因和蛋白的表達,增加RUNX2在Alpl基因啟動子區(qū)的聚集,而對轉錄因子OSX表達的影響不大。Runx2shRNA能減弱T63誘導的RUNX2活性和成骨細胞分化表型,提示T63的促成骨細胞分化效應有賴于RUNX2的表達。在機制上,T63不僅能上調Bmp2、Bmp4和Bmp7的mRNA的表達、誘導Smad1/5/8磷酸化,還能上調TCF轉錄活性、誘導GSK-3β磷酸化及增加β-catenin的核轉移;而BMPs通路抑制劑Noggin和WNT/β-catenin通路抑制劑DKK-1均可以減弱T63誘導的RUNX2的轉錄激活和成骨細胞分化表型,提示兩條信號通路通過影響RUNX2的活性參與調控了 T63的促成骨細胞分化效應。本研究還發(fā)現T63能降低成骨前體細胞內ROS的水平,增強雌激素應答元件ERE的轉錄活性。在對破骨細胞分化的調節(jié)方面,T63不僅抑制共培養(yǎng)體系中成骨細胞介導的破骨細胞的形成,也能直接抑制RANKL誘導的破骨細胞的形成和破骨分化相關基因的表達,并可抑制Rankl基因表達以及MAPKs和Akt信號通路的活化。體內動物實驗結果顯示,與骨質疏松大鼠模型組相比,5mg/kg和20mg/kgT63(灌胃給藥)可以顯著增加模型組的股骨、脛骨和椎骨骨密度,改善骨小梁結構;同時增加模型組血清ALPL水平和股骨橫切面成骨細胞的數目,抑制其血清NTX-1水平和股骨橫切面破骨細胞的形成。結論:經高通量篩選獲得的化合物T63具有良好的體內外抗骨質疏松活性。T63可通過激活BMPs和經典WNT/β-catenin雙重信號通路誘導RUNX2轉錄激活,進而促進成骨細胞分化和骨形成。T63還可通過下調MAPKs和Akt信號通路的活化而抑制破骨細胞分化和功能。該化合物有望發(fā)展成為潛在的抗骨質疏松候選藥物。二、NF-κB轉錄活性抑制劑的篩選及秦皮甲素抑制破骨細胞分化效應的研究研究目的:以NF-κB為潛在分子靶標,完成對天然化合物庫的初步篩選。對篩選得到的活性化合物秦皮甲素(AES)進行體內外抗骨質疏松活性的評價和機制的研究。研究方法:利用脂質體轉染法將含有熒光素報告基因的NF-κB質粒轉染進RAW264.7細胞建立反映NF-κB轉錄活性的細胞篩選模型。利用熒光素報告基因系統檢測在細胞篩選模型中天然化合物對熒光素酶活性的影響。MTT法檢測篩選得到的陽性化合物AES對RAW264.7細胞毒性作用。TRAP染色、F-actin染色和PCR等方法研究AES對RANKL誘導的破骨細胞形成、融合以及破骨分化相關基因mRNA表達的影響。結合Western blot、雙熒光素報告基因系統和基因過表達等技術,研究AES抑制破骨細胞分化的分子機制。利用p-NPP法及茜素紅染色等方法,考察AES對MC3T3-E1細胞成骨細胞分化的影響。同上方法采用卵巢去勢聯合地塞米松建立骨質疏松模型大鼠,研究AES的體內抗骨質疏松活性。實驗結果:本研究構建了 NF-κB抑制劑篩選模型,從132個天然化合物中篩選發(fā)現AES可有效抑制NF-κB活性。5-20μM kMAES在不產生毒性的同時,能劑量依賴地抑制RANKL誘導的破骨細胞的形成和F-actin環(huán)的形成,同時抑制Trap、Atp6v0d2、Cathepsin K、Mmp-9和Nfatc1等破骨分化相關基因的表達。研究發(fā)現,AES不僅能抑制RANKL下游的NF-κB通路,也能抑制MAPKs通路的激活。此外,AES能抑制Rank基因的表達;過表達RANK可以減弱AES對破骨細胞形成和NF-κB活性的抑制作用。AES對成骨細胞分化的影響作用不明顯。動物實驗結果顯示,與骨質疏松大鼠模型組相比,20 mg/kg和100 mg/kg AES可有效升高骨密度及骨體積分數,并降低血清中NTX-1水平。結論:本研究基于NF-κB轉錄活性建立細胞篩選模型,并從132個天然化合物中篩選得到活性化合物AES。AES能抑制RANKL誘導的破骨細胞分化,抑制骨質疏松模型大鼠骨量的丟失。AES對破骨細胞分化的調節(jié)作用可能與AES抑制Rank基因表達、進而影響RANKL下游NF-κB等信號通路有關。
【學位授予單位】：北京協和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R914;R965

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

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本文編號：2676648