【摘要】：研究背景:急性淋巴細(xì)胞白血病(AcuteLymphoblastic Leukemia,ALL)是一種淋巴祖母細(xì)胞惡性增殖的血液性疾病。ALL同時可見于兒童和成人,常見于2-5歲兒童。隨著治療儀器和手段的進步,目前兒科ALL治愈率高達(dá)90%,但成人治愈率僅為30%左右。對于難治性/復(fù)發(fā)性ALL,患者治愈率和5年生存率低,這仍然是國際治療的難題。因此,新治療策略的開發(fā)和腫瘤分子機制的研究顯得尤為重要。硼替佐米(bortezomib)是一種合成的高選擇性26S硼酸鹽蛋白酶體抑制劑,2003年被美國FDA批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性骨髓瘤,并于2006年底批準(zhǔn)治療套細(xì)胞淋巴瘤。Bortezomib是目前研究最為廣泛的一種蛋白酶體抑制劑,體外實驗表明它對60種腫瘤細(xì)胞都有明顯的抑制作用。且對多種血液疾病都有良好療效,在ALL治療上處于臨床Ⅱ/Ⅲ期。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B cell lymphoma-2,Bcl-2)是最早研究與細(xì)胞凋亡相關(guān)的一類原癌基因。Bcl-2家族蛋白分為抗凋亡蛋白(Bcl-2,Bcl-xl,Bcl-w,Mcl-1和A1等)和促凋亡蛋白(Bak,Bax,Bok,Bik,Bim等)。Bcl-2家族蛋白主要定位于線粒體,并且通過線粒體途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡。由于大部分腫瘤細(xì)胞過表達(dá)Bcl-2等蛋白,研究員開發(fā)了一系列的Bcl-2家族蛋白抑制劑,其中包括obatoclax,AT-101,ABT-199 等等。研究目的:自噬和泛素-蛋白酶體是細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的兩大通路,前者主要負(fù)責(zé)降解長壽蛋白和損傷的細(xì)胞器,后者則負(fù)責(zé)短壽蛋白的降解。bortezomib是一種有效的26S硼酸鹽蛋白酶體抑制劑,但同時可以誘導(dǎo)自噬引起藥物耐受。單獨使用bortezomib后,發(fā)現(xiàn)會造成一些抗凋亡蛋白的蓄積,如Mcl-1。因此,本課題中我們設(shè)計并探索了 bortezomib 聯(lián)用 Bcl-2 抑制劑(obatoclax、AT-101、ABT-199)是否在急性淋巴白血病細(xì)胞上出現(xiàn)協(xié)同細(xì)胞毒性作用的實驗方案。并對bortezomib聯(lián)用obatoclax的協(xié)同細(xì)胞毒性機制進行初步的闡釋和研究,希望能為臨床研究中解決單藥活性低、易耐藥提供一個有價值的參考,也為臨床上藥物聯(lián)合應(yīng)用提供一個新的治療方案。研究方法:1.MTT檢測藥物的細(xì)胞毒性作用2.Western blot檢測bortezomib單獨處理細(xì)胞后抗凋亡蛋白的變化情況3.MTT聯(lián)合應(yīng)用CompuSyn軟件計算藥物聯(lián)用指數(shù)及聯(lián)用前后濃度變化4.流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot分別檢測bortezomib聯(lián)用obatoclax對白血病細(xì)胞凋亡的影響5.RT-PCR檢測bortezomib聯(lián)用obatoclax引起白血病細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的影響6.ER stress抑制劑TUDC對藥物聯(lián)用組細(xì)胞活性和凋亡的影響1)MTT檢測TUDC對藥物聯(lián)用組細(xì)胞活性的影響。2)流式細(xì)胞儀檢測TUDC對藥物聯(lián)用組細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)論:1.Bortezomib、Obatoclax、AT-101和ABT-199單獨使用可以顯著性抑制白血病細(xì)胞Jurkat和Nalm-6細(xì)胞活力。2.Bortezomib單獨處理細(xì)胞后造成抗凋亡蛋白Mcl-1顯著蓄積。3.Bortezomib聯(lián)用Obatoclax可以協(xié)同誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡,但Bortezomib分別聯(lián)用ABT-199、AT-101在MTT上并未發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用。4.Bortezomib聯(lián)用Obatoclax可以同時阻斷自噬和泛素-蛋白酶體兩大蛋白降解通路。5.Bortezomib聯(lián)用Obatoclax引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生協(xié)同作用。6.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑(TUDC)可減少由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)藥物聯(lián)用組(bortezomib + obatoclax)細(xì)胞的凋亡。
【圖文】：

根據(jù)各藥物的ＩＣ５。確定兩藥聯(lián)用的摩爾比，我們選擇藥物作用濃度為１／４逡逑ＩＣ５０、１／２ＩＣ５０、ＩＣ５０、２ＩＣ５０、４ＩＣ５０，通過邋ＭＴＴ邋比色方法，測量邋０Ｄ邋值，并應(yīng)逡逑用ＣｏｍｐｕＳｙｎ軟件，計算藥物聯(lián)用指數(shù)ＣＩ及聯(lián)用前后濃度的變化。從圖１－３、逡逑１－４與表１－２、１－３中可看到，兩藥聯(lián)用指數(shù)ＣＩ均小于ｌ，ｊｕｒｋａｔ的ＣＩ邋（０．５２？０．８４）、逡逑Ｎａｌｍ－６的ＣＩ邋（０．４８？０．７４），，說明兩藥聯(lián)用在ｊｕｒｋａｔ和ｎａｌｍ６細(xì)胞中都具有協(xié)同逡逑細(xì)胞毒性作用。從圖１－５看到，在Ｊｕｒｋａｔ上，ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ分別聯(lián)用ＡＢＴ－１９９、逡逑ＡＴ－１０１邋的邋ＣＩ邋為（０．８－１．６邋），（邋１．０－２．３邋）；在邋Ｎａｉｍ邋６邋上，ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ邋分別聯(lián)用邋ＡＢＴ－１９９、逡逑ＡＴ－１０１的ＣＩ為（０．８－２．１），（０．７－１．４），兩組細(xì)胞的平均ＣＩ值都接近或大于１，逡逑說明兩藥協(xié)同效果不佳或有拮抗作用。逡逑Ｊｕｒｋａｔ逡逑１２0＿邐0ｂａ逡逑＾邋ｉ00＾—邋邐邋ｂｏｒ逡逑＾邐邐邐邐邐邋－ａ－邋0ｂａ＋ｂｏｒ逡逑０邋Ｈ邐１邐１邐１邐１邐１逡逑ｏｂａｔｏｃｌａｘ邐（ｊｘＭ）邐０邐０．２５邐０．５邐１．０邐２．０邐４．０逡逑ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ邐（ｎＭ）邐０邐１．２５邐２．５邐５．０邐１０邐２０逡逑ＣＩ邐０．５２邐０．５３邐０．５３邐０．５５邐０．８４逡逑圖１－３：邋Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ及ｏｂａｔｏｃｌａｘ對人白血病細(xì)胞ｊｕｒｋａｔ的活力曲線及聯(lián)用指數(shù)（ＣＩ）邋（４８邋ｈ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－３邋：邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ａ

根據(jù)各藥物的ＩＣ５。確定兩藥聯(lián)用的摩爾比，我們選擇藥物作用濃度為１／４逡逑ＩＣ５０、１／２ＩＣ５０、ＩＣ５０、２ＩＣ５０、４ＩＣ５０，通過邋ＭＴＴ邋比色方法，測量邋０Ｄ邋值，并應(yīng)逡逑用ＣｏｍｐｕＳｙｎ軟件，計算藥物聯(lián)用指數(shù)ＣＩ及聯(lián)用前后濃度的變化。從圖１－３、逡逑１－４與表１－２、１－３中可看到，兩藥聯(lián)用指數(shù)ＣＩ均小于ｌ，ｊｕｒｋａｔ的ＣＩ邋（０．５２？０．８４）、逡逑Ｎａｌｍ－６的ＣＩ邋（０．４８？０．７４），說明兩藥聯(lián)用在ｊｕｒｋａｔ和ｎａｌｍ６細(xì)胞中都具有協(xié)同逡逑細(xì)胞毒性作用。從圖１－５看到，在Ｊｕｒｋａｔ上，ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ分別聯(lián)用ＡＢＴ－１９９、逡逑ＡＴ－１０１邋的邋ＣＩ邋為（０．８－１．６邋），（邋１．０－２．３邋）；在邋Ｎａｉｍ邋６邋上，ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ邋分別聯(lián)用邋ＡＢＴ－１９９、逡逑ＡＴ－１０１的ＣＩ為（０．８－２．１），（０．７－１．４），兩組細(xì)胞的平均ＣＩ值都接近或大于１，逡逑說明兩藥協(xié)同效果不佳或有拮抗作用。逡逑Ｊｕｒｋａｔ逡逑１２0＿邐0ｂａ逡逑＾邋ｉ00＾—邋邐邋ｂｏｒ逡逑＾邐邐邐邐邐邋－ａ－邋0ｂａ＋ｂｏｒ逡逑０邋Ｈ邐１邐１邐１邐１邐１逡逑ｏｂａｔｏｃｌａｘ邐（ｊｘＭ）邐０邐０．２５邐０．５邐１．０邐２．０邐４．０逡逑ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ邐（ｎＭ）邐０邐１．２５邐２．５邐５．０邐１０邐２０逡逑ＣＩ邐０．５２邐０．５３邐０．５３邐０．５５邐０．８４逡逑圖１－３：邋Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ及ｏｂａｔｏｃｌａｘ對人白血病細(xì)胞ｊｕｒｋａｔ的活力曲線及聯(lián)用指數(shù)（ＣＩ）邋（４８邋ｈ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－３邋：邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ａ
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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