【摘要】：本課題設計了一種智能化的pH敏感免疫脂質體(PDL),聯(lián)合應用多西紫杉醇(docetaxel,DTX)介導的化學療法和PD-L1介導的腫瘤免疫療法來協(xié)同發(fā)揮高效的抗腫瘤效應。對所制備脂質體的理化性質、釋藥行為、體外細胞毒性、體內藥效學、體內外安全性及其抗腫瘤機制進行探究,為該制劑進行臨床轉化,進一步應用于腫瘤治療提供理論及實驗基礎。具體研究內容如下:(1)共載多西他賽和PD-L1抗體免疫脂質體的制備、表征及釋藥行為考察通過薄膜水化法和后插入法成功制備載DTX脂質體和共載DTX及PD-L1抗體的脂質體,抗體與PEG通過酰胺結合的方式被修飾在脂質體表面。TEM結果顯示脂質體外觀圓整,分布均勻;DTX-LP和PDL的平均粒徑分別為113.6±2.991 nm和126.8±0.651 nm,PDI為0.252±0.005和0.232±0.010。在經過抗體修飾后,平均粒徑上升,同時ζ電勢由-41.5±0.306上升至-31.5±0.961,初步表明抗體已成功連接至脂質體表面。SDS-PAGE和共定位實驗進一步證實脂質體表面抗體的成功連接。HPLC法測定DTX-LP的包封率高達94.32±0.10%,載藥量約為5.91±0.001%。PDL包封率為91.39±1.09%,載藥量為4.49±0.042%。脂質體表面較大的負電荷可幫助脂質體載溶液中更加穩(wěn)定,并有效減少溶血現(xiàn)象的發(fā)生,具有較好的安全性和穩(wěn)定性。通過動態(tài)膜透析法對脂質體的體外釋藥行為進行研究,結果顯示在pH=7.4的中性條件下,DTX-LP和PDL都比游離藥物釋放速率要慢,在72h時累計釋放率才為57.99%和62.41%,明顯延長藥物釋放行為,保證了到達靶組織前脂質體的穩(wěn)定性;而在pH5.0介質中藥物能較快速地從脂質體中釋放出來,72h釋放量可分別達86.80%和90.03%,DTX-LP和PDL的體外釋放具有明顯的pH敏感性,在靶向部位可快速釋放藥物。(2)免疫脂質體的體外細胞毒性及靶向能力評價選取黑色素瘤B16-F10細胞為研究對象,在細胞水平研究各制劑的活性及功能。由于作用靶點是腫瘤細胞表面的PD-L1,首先通過流式細胞術驗證B16-F10細胞表面PD-L1的表達。通過CCK-8法測得空白載體細胞毒性低、生物相容性好。在給藥組中,細胞存活率不同給藥組中均存在時間依賴性和濃度依賴性。48 h時游離DTX、DTX-LP和PDL半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為12.46μg/mL、6.60μg/mL和0.93μg/mL,DTX-LP和PDL的IC50分別相當于游離藥物的0.52倍和0.07倍,充分表明當主動靶向的脂質體具有更高的細胞毒性。凋亡實驗結果也表明聯(lián)合遞送比單獨給藥擁有更強的凋亡誘導能力。DTX-LP和和PDL的凋亡誘導率分別為15.74±2.67%和26.17士3.71%明顯高于游離DTX的9.26±0.90%制劑的毒性隨著納米化和主動靶向增加。采用免疫熒光染色和流式探究脂質體入胞機制和效率,結果顯示PDL的攝取高于DTX-LP則是由于B16-F10細胞表而存在PD-L1,PDL的主動靶向能力使其更多的富集于胞內。競爭性實驗也進一步驗證其靶向能力是由PD-L1所介導。因此可初步推論,主動靶向脂質體能夠顯著提高藥效,幫助藥物更多的富集于靶部位發(fā)揮作用。(3)免疫脂質體的體內藥效學及主動靶向能力研究將B16-F10黑色素瘤細胞接種于小鼠皮下,構建小鼠原位黑色素瘤模型,在動物水平檢驗不同藥物和脂質體的相關藥效學性質及靶向能力。采用脂質小分子熒光探針DiR替代DTX制備相應的脂質體(DiR-LP和DiR-PDL),通過使用近紅外活體成像系統(tǒng)可實時監(jiān)測游離藥物或載體在體內的生物分布行為。所制備的DiR-PDL在體內觀測和離體成像的腫瘤組織中均表現(xiàn)出更多富集,而在游離藥物組中幾乎檢測不到腫瘤組織分布。DiR-PDL和DiR-LP在腫瘤組織的積累分別比游離藥物高11.98倍和3.95倍,說明免疫脂質體可以有效地靶向腫瘤組織,從而減少副作用。體內藥效學結果顯示PDL具有最強的療效,小鼠生存時間明顯延長,且未造成小鼠體重降低。腫瘤組織切片TUNEL免疫熒光和Ki67免疫組化染色與藥效學結果相符,PDL組的陽性率分別為58.81±14.16%和65.95±3.5%。充分驗證免疫化學療法可增強抗腫瘤免疫,同時有效殺傷腫瘤細胞來抑制腫瘤生長和延長小鼠存活率。(4)免疫脂質體的安全性評價及初步機制研究考察脂質體的安全性及抗腫瘤作用機制,為其臨床轉化提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。通過測定肝功能指標ALT和AST及腎功能指標BUN的水平來間接評估藥物的安全性。結果顯示各參數(shù)均在正常范圍內,初步表明制劑未對肝腎產生明顯實質損傷。主要器官組織病理學檢查顯示,除游離藥物組合外,各組織切片形態(tài)未表現(xiàn)出明顯的病理異常。表明游離藥物組合存在相對嚴重的全身毒性。進一步驗證PDL可降低副作用。同時,通過免疫熒光染色對抗腫瘤免疫機制作初步探討,PDL組可觀察到腫瘤組織中富集最多的TILs和的顆粒酶B,表明免疫脂質體可促進體內TILs的募集和毒性。因此可推斷PDL通過關閉PD-1/PD-L1途徑引發(fā)CD8+T細胞介導的強效腫瘤細胞殺傷,與DTX的細胞毒性協(xié)同產生強力抗腫瘤作用,同時具有良好的安全性和應用前景。
【圖文】：

逑變導致膠質細胞瘤中的ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ通路激活３°，而９ｐ２４．邋１基因在某些淋巴瘤中逡逑的易位或擴增３１’３２，最終可導致ＰＤＬ１在大多數(shù)腫瘤細胞表面廣泛表達（圖１）。逡逑ＰＤ－Ｌ１邐，／＇１邋ｌｎｎａ，ｅ邋＿逡逑？Ｑ邋－＾—邋ｒ－／／邋！逡逑一邋Ｐｉ．＼邐ＴＵｍｏｒｃｅ，，邋Ｕ邋邐：曼邐：逡逑＾！邋－＾４＾，邋Ｊｊ＾ｙ邋＜－：：－邋－■逡逑？邋：y�，（八，－音－，０櫫x希獺蓿危荊澹觥瑰危擼澹悖幌﹀義�、一人NB逡逑圖１腫瘤內部ＰＤＬｌ表達的機制。腫瘤細胞的ＰＤＬｌ的組成型廣泛（先天）逡逑表達被認為是由失調的信號傳導途徑或染色體改變和擴增驅動的。腫瘤細胞和巨逡逑噬細胞的ＰＤＬ１的局部表達發(fā)生在腫瘤細胞群表面，同時分泌促炎因子如干擾素逡逑－ｙ邋（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，，邋ＩＦＮ－ｙ）＝邋ＰＤＬｌ與ＰＤ１分子的連接將下調Ｔ細胞功能，產生抑逡逑制抗腫瘤免疫的負反饋結果。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｆｏｒ邋ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ邋ＰＤＬｌ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．邋Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ邋ｂｒｏａｄ逡逑（ｉｎｎａｔｅ）邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ邋ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ邋ｃｅｌｌ邋ｄｅａｔｈ邋１邋ｌｉｇａｎｄ邋１邋（ＰＤＬｌ）邋ｂｙ逡逑ｔｕｍｏｒ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｓ邋ｔｈｏｕｇｈｔ邋ｔｏ邋ｂｅ邋ｄｒｉｖｅｎ邋ｂｙ邋ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ

４．１設計思路逡逑近來研究者普遍認為某些化療可以與免疫療法協(xié)同作用，從而改善療效和預逡逑后。本課題設計了一種智能化的ｐＨ敏感免疫脂質體（ＰＤＬ），選擇二油酰磷脂酰逡逑乙醇胺（ＤＯＰＥ）和大豆卵磷脂（ＳＰＣ）為磷脂雙分子層的基礎材料，琥珀酸膽固醇逡逑單酯（ＣＨＥＭＳ）為ｐＨ敏感材料，該系統(tǒng)以ｐＨ敏感性脂質體為基礎，雙分子層內逡逑負載化療藥物多西他賽；脂質體外層ＰＥＧ鏈上接ＰＤ－Ｌ１單克隆抗體（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ逡逑ａｎｔｉｂｏｄｙ，邋ｍＡｂ）。在脂質體表面修飾的ＰＤ－Ｌ１邋ｍＡｂ，可以準確地耙向腫瘤細胞，關逡逑閉免疫抑制性的ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１通路，同時ＤＴＸ可直接殺傷腫瘤細胞。通過薄膜水逡逑化法制備脂質體，聯(lián)合應用多西他賽（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ，ＤＴＸ）介導的化學療法和ＰＤ－Ｌ１逡逑介導的腫瘤免疫療法來協(xié)同發(fā)揮高效的抗腫瘤效應。對所制備脂質體的理化性質、逡逑體內外釋藥行為、體外細胞毒性、體內藥效學、體內外安全性及其抗腫瘤機制進逡逑行探究，為該制劑后續(xù)臨床轉化，進一步應用于腫瘤治療提供理論及實驗基礎。逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R943

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 ;楊鶯歌:全球納米技術市場未來呈現(xiàn)可喜發(fā)展態(tài)勢[J];中國粉體工業(yè);2006年06期

2 ;新加坡南大利用納米技術減低潔凈水源成本[J];給水排水動態(tài);2007年04期

3 ;納米技術在包裝領域的性能及廣泛應用[J];中國粉體工業(yè);2007年02期

4 ;納米技術及材料在空氣凈化中的應用[J];中國粉體工業(yè);2007年02期

5 ;韓國計劃2015年晉升為納米技術三大強國之一[J];中國粉體工業(yè);2009年03期

6 陳子薇;馬力;;納米技術倫理問題與對策研究[J];科技管理研究;2018年24期

7 汪津;;納米技術在紡織品染整中的應用[J];印染;2017年20期

8 張奧;;試論納米技術在汽車研發(fā)中的應用[J];山東工業(yè)技術;2018年04期

9 李喜樂;楊玉杰;張攀;;淺談納米技術在印刷行業(yè)中的應用[J];信息記錄材料;2018年04期

10 張莉;程曉宇;劉洪霞;;農業(yè)納米技術應用分析與展望[J];農業(yè)展望;2018年05期

相關會議論文 前10條

1 沈可欣;房學東;;胃腸道疾病中納米技術在診斷與治療中的應用[A];第十九屆中國科協(xié)年會——分10微創(chuàng)外科高峰論壇論文集[C];2017年

2 樊春海;;基于DNA納米技術的有序界面構筑與生物應用[A];第十五屆全國光化學學術討論會會議論文集[C];2017年

3 ;21世紀高新技術——納米技術[A];中國煤炭學會簡訊（第109期）[C];2004年

4 郭濤;;納米技術在生物醫(yī)學和藥學領域中的應用與展望[A];新世紀 新機遇 新挑戰(zhàn)——知識創(chuàng)新和高新技術產業(yè)發(fā)展（下冊）[C];2001年

5 馬躍東;;積極探索納米技術產業(yè)化的途徑[A];加入WTO和中國科技與可持續(xù)發(fā)展——挑戰(zhàn)與機遇、責任和對策（上冊）[C];2002年

6 曾文峰;張發(fā)云;張春玲;梁偉;;從分子到藥物—納米技術的作用[A];全國第十二屆生化與分子藥理學學術會議論文集[C];2011年

7 王翰;;納米技術的可專利性分析[A];專利法研究（2010）[C];2011年

8 王國慶;;納米技術與軍事航天系統(tǒng)[A];納米材料和技術應用進展——全國第二屆納米材料和技術應用會議論文集（下卷）[C];2001年

9 袁昊;龔文琪;劉朝華;;納米技術在礦山環(huán)境保護中的應用與展望[A];西部礦產資源開發(fā)利用與保護學術會議論文集[C];2002年

10 羅曾義;;超聲在納米技術中的一些應用和探索[A];中國聲學學會2002年全國聲學學術會議論文集[C];2002年

相關重要報紙文章 前10條

1 本報記者 徐立明;把科研當做生活[N];科學時報;2011年

2 劉錦淮　博士 中科院合肥智能機械研究所研究員 博士生導師;仿生傳感器：納米技術成為最熱選擇[N];科學時報;2011年

3 本報見習記者 程唯珈;光學與納米技術的“浪漫聯(lián)姻”[N];中國科學報;2018年

4 蘇報記者 薛卿;“科研就是走沒人走過的路”[N];蘇州日報;2019年

5 黃愛萍;人才引領納米技術產業(yè)創(chuàng)新高[N];蘇州日報;2019年

6 唐曉雯 周建琳;納米技術產業(yè)勇攀新高峰[N];蘇州日報;2019年

7 記者 劉霞;納米技術使特種鋁合金變得可焊接[N];科技日報;2019年

8 何彩儷 張曄;院士：別把納米技術當成企業(yè)名片[N];中國航空報;2018年

9 實習生 何彩儷 本報記者 張曄;院士：別把納米技術當成企業(yè)名片[N];科技日報;2018年

10 記者 石飛月;2020年臺積電5納米技術支持量產[N];北京商報;2019年

相關博士學位論文 前10條

1 朱曉林;STS視域下的納米技術的善治[D];大連理工大學;2017年

2 陳首珠;當代技術—倫理實踐形態(tài)研究[D];東南大學;2015年

3 張凱;納米技術對社會影響的風險分析[D];天津大學;2010年

4 張冬仙;原子力顯微術的新方法研究及新型原子力顯微鏡系統(tǒng)研制[D];浙江大學;2004年

5 馬海松;汽車用高性能聚合物納米復合材料的制備與研究[D];吉林大學;2009年

6 王則君;核酸納米技術在活細胞成像和癌癥免疫治療中的應用[D];中國科學院大學(中國科學院上海應用物理研究所);2018年

7 Javed Rafique;電紡法制備定向納米材料的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學;2008年

8 王嫦君;干眼癥緩釋淚道栓設計關鍵技術及其相關性能初步研究[D];浙江大學;2011年

9 劉曉曼;從黃柏炭止血作用及其機制研究探討“炒炭止血”與“燒灰存性”[D];北京中醫(yī)藥大學;2018年

10 高思田;計量型原子力顯微鏡的研究[D];天津大學;2007年

相關碩士學位論文 前10條

1 古自力;基于納米技術共載多西他賽和PD-L1抗體的免疫化療[D];山東大學;2019年

2 劉玲歌;基于延遲熒光染料的熒光納米粒子的研究[D];大連理工大學;2018年

3 劉楊;責任倫理視閾下的納米技術安全[D];大連理工大學;2018年

4 張程;納米技術檢測乙肝病毒變異位點方法的建立及其應用[D];首都醫(yī)科大學;2017年

5 盧繼光;滾子鏈應用納米技術的初步研究[D];吉林大學;2005年

6 曲鐘陽;基于德爾菲法的技術預見[D];大連理工大學;2013年

7 徐軍偉;新興技術發(fā)展的社會風險及其應對策略研究[D];華南理工大學;2015年

8 李金星;催化微馬達[D];復旦大學;2012年

9 陳佳麗;倫理學視閾下的“負責任創(chuàng)新”研究[D];南京林業(yè)大學;2016年

10 李中洲;納米技術在熱虹吸管中的應用[D];華中科技大學;2006年

本文編號：2653625