【摘要】：目前,全球黑色素瘤發(fā)病率逐漸上升,其生存率低、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高,極大威脅了患者的生命。對此,本課題采用光控基因表達技術(shù)以及腫瘤免疫的方法來治療黑色素瘤。本文擬采用維生素E琥珀酸酯(VES)和聚乙烯亞胺(PEI),通過引入二硫鍵(-ss-)合成兩親性VES-ss-PEI聚合物,在水中自組裝制備陽離子膠束,采用靜電吸附作用包載抗原卵清蛋白或白喉毒素基因等藥物,載藥膠束仍呈正電性,通過靜電相互作用力包被由聚乙二醇(PEG)連有Arg-Gly-Asp(RGD)三肽的透明質(zhì)酸(HA)外殼HA-PEG-RGD,構(gòu)建納米遞藥系統(tǒng)。采用光控基因表達技術(shù),白喉毒素pDNA在腫瘤細胞內(nèi)產(chǎn)生白喉毒素,來殺滅腫瘤細胞;采用卵清蛋白(OVA)標記腫瘤細胞并產(chǎn)生抗原性,利用激活的特異性免疫細胞來抑制腫瘤生長,通過體內(nèi)外實驗研究黑色素瘤的抑制效果,為治療黑色素瘤的研究奠定了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。首先合成了載體材料VES-ss-PEI與HA-PEG-RGD,通過核磁氫譜、核磁碳譜、紅外光譜等手段確定材料的成功合成。采用超聲法制備陽離子納米膠束VES-ss-PEI,其粒徑范圍在50.8～70.4 nm,電位在48.8～53.4 mV之間。進一步在表面包被多功能外殼,制備得到VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束,其粒徑范圍在64.4～82.8 nm,電位在-16.7～-41.2 mV之間。制備的納米膠束球形完整,粒徑均一,具有優(yōu)良的體內(nèi)外穩(wěn)定性。采用近紅外染料IR-775考察納米膠束在體內(nèi)的分布特性。結(jié)果表明,與游離IR-775組相比,IR-775@VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束組的血中AUC0-2h增加4.4倍,肝臟和脾臟中AUC0-24 h分別增加3.3倍和1.5倍,活體成像實驗表明該納米膠束具有腫瘤靶向能力的同時,也會富集于肝臟和脾臟中。利用靜電吸附作用包載卵清蛋白(OVA),采用超聲法制備得到了粒徑為55.9 nm的OVA@VES-g-PEI納米膠束,OVA載藥率為28.8%,通過靜電吸附作用包被多功能外殼制得OVA@mPEG-g-HA/VES-g-PEI納米膠束,其粒徑增大到72.1 nm。OVA@mPEG-g-HA/VES-g-PEI納米膠束在pH 7.4的PBS釋放介質(zhì)中具有一定的緩釋效果。與游離OVA組相比,OVA@mPEG-g-HA/VES-g-PEI納米膠束組能顯著提高細胞對蛋白的攝取能力(p0.01),能夠幫助蛋白從溶酶體中逃逸,逃逸的蛋白能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加工成短肽并形成MHC I-OVA257-264復(fù)合物標記在腫瘤細胞表面,同時能顯著增加樹突細胞表面標志物CD80和CD86的表達量,表明mPEG-g-HA/OVA@VES-g-PEI納米膠束能有效刺激樹突細胞并使其成熟,具有明顯的抑瘤效果�？疾觳煌琋/P條件下載基因納米膠束的粒徑、電位、包載基因能力、穩(wěn)定性確定最佳N/P為10,并制備得到pDNA@VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束。該納米膠束能提升基因穩(wěn)定性,在PBS溶液和含有10 mM的谷胱甘肽還原酶(GSH)的PBS溶液中,72 h時基因累計釋放率分別為14.3%和62.0%,表明其具有還原敏感性。細胞攝取和轉(zhuǎn)染實驗表明,包載光控綠色熒光蛋白基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束能顯著提高基因的攝取和轉(zhuǎn)染能力,通過控制藍光照射強度,能調(diào)控綠色熒光蛋白在細胞內(nèi)的表達量。體外MTT實驗、3D腫瘤球?qū)嶒灐⒓毎麆澓蹖嶒�、細胞凋亡實驗表�?包載光控白喉毒素基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束經(jīng)過藍光照射后具有明顯的腫瘤細胞抑制能力。小鼠抑瘤實驗結(jié)果表明,經(jīng)過光控基因表達系統(tǒng)治療的荷瘤小鼠,與腫瘤模型組相比,包載光控白喉毒素基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束組的腫瘤抑制率為79.2%,荷瘤小鼠的生存率從10%提高到了100%,顯示出其具有顯著的腫瘤抑制能力。腫瘤組織切片染色實驗表明,腫瘤細胞有明顯損傷,腫瘤新生血管細胞數(shù)量明顯減少,表明包載光控白喉毒素基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束在經(jīng)過藍光照射治療后能夠抑制腫瘤的生長,組織臟器切片染色實驗表明,藍光未照射的組織無明顯毒副作用。初步考察了光控基因表達系統(tǒng)聯(lián)合OVA免疫的抗黑色素瘤效果,為光控基因表達免疫白喉毒素與免疫治療聯(lián)合治療黑色素瘤的治療新策略提供理論依據(jù)。
【圖文】：

通過雙功能聚乙二醇（ＰＥＧ）、透明質(zhì)酸（ＨＡ）與Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ三肽（ＲＧＤ）逡逑合成ＨＡ－ＰＥＧ－ＲＧＤ，通過靜電相互作用力包被在載藥膠束表面構(gòu)建免疫納米遞藥系統(tǒng)逡逑（見圖１．５）。利用光控基因表達系統(tǒng)可控地在腫瘤細胞內(nèi)表達白喉毒素的Ａ片段（ＤＴＡ）逡逑蛋白催化ＮＡＤ＋上的ＡＤＰ核糖基向ＥＦ－２轉(zhuǎn)移，，進而抑制細胞的胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成而表現(xiàn)逡逑毒性來殺傷腫瘤細胞及腫瘤新生血管細胞（見閣１．６途徑①）。由白喉毒素殺死的腫瘤細逡逑胞釋放出癌癥相關(guān)抗原經(jīng)樹突細胞呈遞后激活Ｔ細胞，從而X椉又琢鑾潁韻赴氖義狹浚跡保鍛揪盯郟�。同时利用聛嗗蛋白（Ｏ｀嵙）作为惋劶児原，栽r恢琢魷赴閎『簀義

本文編號：2651684