【摘要】：醫(yī)藥用途的多肽因其具有特異性好、免疫原性低的優(yōu)勢(shì),在藥物研發(fā)中愈發(fā)受重視。近些年隨著藥用多肽以及疾病監(jiān)測(cè)相關(guān)多肽試劑研究的發(fā)展,解決了人類一系列疾病的發(fā)現(xiàn)和治療等問(wèn)題。藥用多肽,尤其是富含二硫鍵類小蛋白,研究其二硫鍵折疊或變構(gòu)帶來(lái)的功能影響對(duì)其自身藥物改性至關(guān)重要。所以針對(duì)富含二硫鍵類藥用多肽,發(fā)展新方法研究其二硫鍵功能并改性具有重要意義及應(yīng)用價(jià)值。而檢測(cè)用途的多肽試劑的發(fā)展則為疾病的檢測(cè)和藥物的篩選提供了有力的工具。圍繞醫(yī)藥用途的多肽研究,本論文主要內(nèi)容和結(jié)論分為以下兩個(gè)部分:鐵調(diào)素(Hep)是含有四對(duì)二硫鍵的信號(hào)肽,與受體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FPN)結(jié)合后使FPN內(nèi)吞并降解。抑制FPN將胞內(nèi)鐵離子過(guò)度轉(zhuǎn)運(yùn)至血液的功能,可以避免引發(fā)血色沉著病、阿爾茨海默癥等癥狀的發(fā)生。臨床上將Hep作為相關(guān)疾病的治療藥物已取得了部分成功。但是目前對(duì)Hep和FPN的結(jié)合模式是否依賴Hep中二硫鍵變構(gòu)的問(wèn)題存在爭(zhēng)議,這阻礙了Hep的進(jìn)一步改性、優(yōu)化。我們首次提出了用非還原性硫醚鍵替代的策略來(lái)檢測(cè)富二硫鍵小蛋白與其受體之間二硫鍵交換的問(wèn)題。該策略具有對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)擾動(dòng)較小,還原條件下穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)。將二氨基二酸合成子通過(guò)SPPS技術(shù)分別嵌入到Hep蛋白中四對(duì)二硫鍵的位置,形成含有硫醚鍵替代的Hep衍生物。我們用Hep衍生物來(lái)驗(yàn)證Hep與FPN的結(jié)合模式,得到了更加明確的結(jié)論:Hep與FPN之間,特別是Hep Cys7與FPN Cys326之間,不存在經(jīng)典的二硫鍵結(jié)合模式。這為藥用Hep的改性提供了新思路:Cys7不是Hep產(chǎn)生活性的決定性因素。經(jīng)改性我們最終獲取了高活性的Mini-Hep。泛素化作為近些年發(fā)現(xiàn)的新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾,在生理健康調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用。在泛素化通路中,去泛素化酶作為一類泛素化修飾的負(fù)調(diào)控蛋白,它的功能紊亂現(xiàn)象與癌癥的發(fā)生息息相關(guān)。目前以去泛素化酶作為抑制靶點(diǎn)的小分子抑制劑藥物的研發(fā)愈發(fā)受重視。前人篩選策略中,Ub-PA作為一種新型的活性探針,相較于Ub-AMC,不存在因小分子抑制劑的吸收或激發(fā)波段與AMC熒光分子重合而帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果的缺陷,因而成為用于去泛素化酶篩選的首選試劑。但Ub-PA存在化學(xué)合成過(guò)程繁瑣產(chǎn)率低的問(wèn)題。為了更好滿足篩選過(guò)程中對(duì)工具的需求,我們發(fā)展了新的半合成策略:利用生物表達(dá)大量獲取合成所需模塊并結(jié)合化學(xué)方法制備關(guān)鍵中間產(chǎn)物泛素酰肼,然后再通過(guò)�；瘜W(xué)反應(yīng)組裝炔烴分子。利用該策略我們可以在短期內(nèi)快速獲取上百毫克級(jí)活性探針。并使用該探針完成了對(duì)USP14去泛素化酶抑制劑IU1的篩選,展示運(yùn)用新合成策略獲取的探針工具具有良好的生物活性。
【圖文】：

圖 1.7 縮合劑活化氨基酸羧酸官能團(tuán)Fig 1.7 Mechanism of the production of racemates during peptide synthesis前常用的活化劑種類按活化官能團(tuán)以及活化機(jī)制可分為銨鹽型、活化脂類二亞胺型等（如圖 1.8）。 1978 年，Gross 等人將 O-(IH-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基異脲六氟（HBTU）用于活化氨基酸羧酸端，來(lái)輔助多肽的合成。開始人們廣泛認(rèn)與氨基酸之間是通過(guò)雜環(huán)上氧-氨基酸羰基之間形活化硫脂。但后來(lái)經(jīng)過(guò)學(xué)的輔助研究，現(xiàn)階段普遍認(rèn)為 HBTU 的活化機(jī)制是通過(guò)胍基官能團(tuán)起酸的作用。在此基礎(chǔ)上，后人又開發(fā)出了多種銨鹽類型的活化劑。O-(7-三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲（HATU），O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',脲六氟磷酸酯（HCTU）。在實(shí)際多肽合成過(guò)程中，O-(7-氮雜苯并三唑-,N′,N′-四甲基脲的活性要大于 O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲酸酯，大于 O-(IH-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基異脲六氟化磷。HATT 組合使用，在提高偶聯(lián)效率的同時(shí)，還可以消除對(duì)映體的副產(chǎn)物。除

圖 1.18 基于絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的連接策略Fig 1.18 Linking strategy based on serine/threonine sites方法成策略在大量獲取合成所需多肽蛋白質(zhì)片段方面，，相對(duì)于化學(xué)全無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。半合成所需的目標(biāo)蛋白可以用生物體直接表達(dá)方法完成復(fù)雜蛋白質(zhì)的體外獲取。成策略在泛素相關(guān)領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用，主要包含 Intein 法、sortase 酶ne 的轉(zhuǎn)硫酯法以及 YUH1 酶解法等。n 法大蛋白來(lái)說(shuō)（大于 300 個(gè)氨基酸殘基），較為經(jīng)濟(jì)的合成途徑是與自然生物表達(dá)片段通過(guò)自然化學(xué)連接反應(yīng)進(jìn)行偶聯(lián)，在體外獲具體步驟是：將內(nèi)含肽的碳末端天冬酰胺突變?yōu)楸彼�，接著�?
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R914

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本文編號(hào)：2643618