【摘要】：背景在受試細(xì)胞外形成的活性代謝物因其生物膜透過性不可確定,其對靶細(xì)胞的遺傳毒作用也受影響。在受試細(xì)胞外形成的帶負(fù)電荷的硫酸基結(jié)合物就不易進(jìn)入靶細(xì)胞,并且一些細(xì)胞色素P450(CYP)酶形成的代謝產(chǎn)物也可能不耐受轉(zhuǎn)運過程。目前遺傳毒性試驗中納入的代謝活性主要是采用大鼠肝S9混合物,在受試細(xì)胞外形成的活性代謝物對生物膜的透過性及對跨距離遷移的承受性可能會有差異,不同代謝產(chǎn)物在生物利用度上的差異對毒效應(yīng)的影響還缺少研究報道。目的本研究旨在揭示不同前致突變物在重組表達(dá)特定活化酶的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性代謝物后,對缺乏特異活化酶的受試細(xì)胞的遺傳毒作用差異,尤其是相較于受試物對相關(guān)代謝細(xì)胞直接作用的差異;以此了解體外代謝活化系統(tǒng)S9混合物對不同受試物遺傳毒性檢測效能的變異,并揭示重組表達(dá)生物轉(zhuǎn)化酶的哺乳動物細(xì)胞系用于遺傳毒性試驗的獨特價值。采用幾種常見的前致突變物,包括1-甲基芘[1-methylpyrene,1-MP,由CYPs和磺基轉(zhuǎn)移酶(SULTs)按次序經(jīng)二步反應(yīng)而活化]、1-羥甲基芘(1-hydroxymethyl pyrene,1-HMP,為1-MP的中間代謝物、依賴SULTs活化的前致突變物)、苯并(a)芘(Benzoapyrene,BaP,需要CYP1A1或CYP1B1活化的前致突變物)和黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1,需要CYP1A2或CYP3A4活化的前致突變物),觀察它們對表達(dá)其活化酶的重組V79細(xì)胞及與這些代謝型細(xì)胞以不同形式相交通的V79對照細(xì)胞誘發(fā)微核的作用。有關(guān)不同細(xì)胞間交通的形式包括:對照細(xì)胞與代謝細(xì)胞等比例混合培養(yǎng),對照細(xì)胞與代謝細(xì)胞通過0.4 μm的微孔和1 mm距離(結(jié)合transwell培養(yǎng)系統(tǒng))進(jìn)行物質(zhì)交換,以及受試細(xì)胞接受化學(xué)物與代謝細(xì)胞孵育后移出的培養(yǎng)液處理。微核試驗的暴露/恢復(fù)時程為3h/21h。以Western blot法分析各受試細(xì)胞表達(dá)特定生物轉(zhuǎn)化酶的相對水平。結(jié)果1-MP對同時表達(dá)人CYP1A2和人SULT1A1的V79衍生細(xì)胞系(V79-hCYP1A2-hSULT1A1)明顯誘發(fā)微核形成,且效應(yīng)呈濃度相關(guān)性。在以下另外的實驗?zāi)Ｐ椭?1-MP也呈現(xiàn)相似的誘發(fā)微核作用:(1)表達(dá)人CYP1A2的重組V79細(xì)胞(V79-hCYP1A2)與表達(dá)人SULT1A1的重組V79細(xì)胞(V79-hSULT1A1)按1:1混合培養(yǎng),(2)應(yīng)用上述transwell系統(tǒng)使受試細(xì)胞V79-hSULT1A1 與V79-hCYP1A2細(xì)胞相交通,以及(3)受試細(xì)胞V79-hSULT1A1接受轉(zhuǎn)移自1-MP與V79-hCYP1 A2細(xì)胞孵育3h的培養(yǎng)液。1-HMP也對V79-hSULT1A1細(xì)胞明顯誘發(fā)微核,然而在以下模型中1-HMP誘發(fā)微核作用都明顯減弱:(1)受試細(xì)胞V79-Mz與V79-hSULT1A1在transwell系統(tǒng)中相交通,(2)V79-Mz細(xì)胞接受轉(zhuǎn)移自1-HMP與V79-hSULT1A]細(xì)胞孵育后的培養(yǎng)液處理。BaP和AFB1對V79細(xì)胞在Aroclor 1254誘導(dǎo)的大鼠肝臟S9混合物存在的條件下,均誘發(fā)微核形成,且效應(yīng)均呈濃度依賴性;與之相比較,相似效應(yīng)也在BaP對重組表達(dá)人CYP1A1的V79細(xì)胞(V79-hCYP1A1)的微核試驗觀察到,而AFB1對V79-hCYP1 A2細(xì)胞的作用強(qiáng)度明顯增高。此外,BaP對與V79-hCYP1A1細(xì)胞相交通的V79-Mz細(xì)胞誘發(fā)微核作用與其對V79-hCYP1A1細(xì)胞的直接作用強(qiáng)度相似;相反,AFB1對與V79-hCYP1A2細(xì)胞相交通的V79-Mz在受試濃度下微核試驗結(jié)果為陰性。結(jié)論本研究結(jié)果提示,1-MP的終毒物(1-甲磺基花,1-sulfoxymethylpyrene)擴(kuò)散進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)會遠(yuǎn)低于不帶電荷的1-HMP;而AFB1的活化產(chǎn)物(AFB1-8,9-環(huán)氧化物)對缺乏代謝能力的靶細(xì)胞的生物可及性很低(遠(yuǎn)低于BaP的活性代謝物),尤其不能經(jīng)受一定的擴(kuò)散距離,難以跨膜及跨距離轉(zhuǎn)運而作用于靶細(xì)胞。本研究結(jié)果支持重組表達(dá)生物轉(zhuǎn)化酶的哺乳動物細(xì)胞系用于遺傳毒性試驗的重要性。
【圖文】：

逑表達(dá)，，在統(tǒng)計學(xué)分析前合并為計數(shù)資料，采用卡方檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；０．０５，邋＊＊尸＜逡逑０．０１，與對照組進(jìn)行比較。１－ＭＰ對Ｖ７９－ｈＣＹＰｌＡ２－ｈＳＵＬＴｌＡｌ細(xì)胞的直接作用是圖３－１相關(guān)逡逑數(shù)據(jù)的重復(fù)表達(dá)，而１－ＨＭＰ對Ｖ７９－ｈＳＵＬＴ丨Ａ１細(xì)胞的直接作用是圖３－３相關(guān)數(shù)據(jù)的重復(fù)表逡逑達(dá)。逡逑Ｆｉｇ．邋３－４邋Ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｉ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋Ｖ７９－ＨＳＵＬＴ１Ａ１邋ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ邋ｆｒｏｍ逡逑１－ＭＰ－ｔｒｅａｔｅｄ邋Ｖ７９－ｈＣＹＰｌＡ２邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ａｓ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈａｔ邋ｉｎ邋Ｖ７９－Ｍｚ邋ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑ｆｒｏｍ邋１－ＨＭＰ－ｔｒｅａｔｅｄ邋Ｖ７９－ｈＳＵＬＴｌＡｌ逡逑Ｃｅｌｌ邋ｇｒｏｗｔｈ／ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ａｎｄ邋ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｉ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋Ｖ７９－ｈＳＵＬＴｌ邋Ａ１邋ｃｅｌｌｓ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｔｏ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｌ－ＭＰ－Ｖ７９－ｈＣＹＰｌ邋Ａ２邋ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｓ邋（ｐａｎｅｌｓ邋Ａ１邋ａｎｄ邋Ａ２）邋ａｎｄ邋ｔｈａｔ邋ｉｎ邋Ｖ７９－Ｍｚ邋ｃｅｌｌｓ逡逑ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｔｏ邋ｌ－ＨＭＰ－Ｖ７９－ｈＳＵＬＴｌＡｌ邋ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｓ邋（ｐａｎｅｌｓ邋Ｂ１邋ａｎｄ邋Ｂ２）．邋Ｔｈｅ邋ｄａｔａ邋ｏｆ邋１－ＭＰ邋ｉｎ逡逑Ｖ７９－ｈＣＹＰｌＡ２－ｈＳＵＬＴｌ邋Ａ１邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｒｉｇｉｎａｌｌｙ邋ａｐｐｅａｒｅｄ邋ｉｎ邋Ｆｉｇ．３－１邋ａｎｄ邋ｒｅｕｓｅｄ邋ｈｅｒｅ邋ｆｏｒ邋ａ邋ｄｉｒｅｃｔ逡逑ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ

二勺，導(dǎo)擬2commUn吻bletO、叮斗hCYp，從仁創(chuàng)!日
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R99

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本文編號：2642930