【摘要】：10-23脫氧核酶是一個(gè)具有高效催化裂解互補(bǔ)RNA的小型DNA分子,在分子、動(dòng)物水平和臨床試驗(yàn)研究證實(shí)了其作為基因治療藥物的巨大潛力。與反義核酸藥物的封閉靶RNA或者依賴體內(nèi)的核酸酶RNaseH剪切靶RNA不同,10-23脫氧核酶自身具有剪切靶RNA的能力。與siRNA類藥物相比,脫氧核酶的DNA結(jié)構(gòu)具有合成簡便和易于修飾的優(yōu)點(diǎn)。因此,發(fā)展脫氧核酶藥物的關(guān)鍵是提高其催化裂解靶RNA的效率。10-23脫氧核酶依賴Mg~(2+)發(fā)揮催化活性,但人體細(xì)胞內(nèi)的鎂離子濃度不足以使其發(fā)揮高效的催化活性。本課題利用核苷類似物在10-23脫氧核酶催化結(jié)構(gòu)域不同位點(diǎn)引入活性功能基胍基、咪唑基,通過這些活性功能基的引入,篩選能提高脫氧核酶催化活性的結(jié)構(gòu)以及修飾位點(diǎn)。本課題設(shè)計(jì)了四種脫氧腺苷類似物,將胍基和咪唑基引入到了腺嘌呤堿基的6-位,8-位和8-氮-7-去氮-腺嘌呤的7-位。通過合成它們的亞磷酰胺單體,利用固相合成獲得了24個(gè)脫氧核酶的修飾結(jié)構(gòu),分別取代了10-23脫氧核酶催化結(jié)構(gòu)域的6個(gè)腺嘌呤位點(diǎn)(A5、A9、A11、A12、A15位,和處于識(shí)別臂的A0位),將胍基和咪唑基引入了催化結(jié)構(gòu)域,其成氫鍵能力在催化結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生了新的相互作用。雖然這些催化結(jié)構(gòu)域的修飾沒有對(duì)脫氧核酶結(jié)合靶RNA的能力產(chǎn)生影響,但可能帶來了局部的構(gòu)象變化,這正是其影響催化效率的關(guān)鍵所在,是我們優(yōu)化結(jié)構(gòu)的切入點(diǎn)。我們將新合成的脫氧核苷類似物插入到這些位點(diǎn),探討其對(duì)10-23脫氧核酶催化活性的影響。已有的研究表明,在10-23脫氧核酶催化結(jié)構(gòu)域的6個(gè)腺嘌呤位點(diǎn),其6-氨基是一個(gè)能影響10-23脫氧核酶催化活性的功能基團(tuán),在此位點(diǎn)上以烷基臂引入額外的胍基(化合物12)和咪唑基(化合物14),在A9位獲得了催化活性提高了3倍的脫氧核酶HJCZ10,以及活性提高了4倍的HJCZ22。這說明在A9位通過在嘌呤環(huán)6位引入胍基、咪唑基能有效地提高10-23脫氧核酶的催化活性。針對(duì)腺嘌呤的五員環(huán)修飾有兩種,一種是在8-氮-7-去氮-腺嘌呤的7位,通過丙基引入了胍基(化合物13),在A9位得到了催化活性提高3倍的脫氧核酶HJCZ16;另一種是在腺嘌呤的8-位引入咪唑基(化合物15),沒有得到催化活性提高的脫氧核酶,說明咪唑基產(chǎn)生的相互作用不利于催化構(gòu)象。這些結(jié)果表明在腺嘌呤環(huán)上的6、7位是比較好的引入活性功能基團(tuán)的位點(diǎn),能夠有效的提高脫氧核酶的催化活性,將化合物12、13、14、15引入到其它五個(gè)腺嘌呤位點(diǎn)和A0位,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,它們都是高度保守的單元。而A9是一個(gè)獨(dú)特的位點(diǎn),可以用于進(jìn)一步修飾獲得更高效的脫氧核酶。
【圖文】：

沒有發(fā)現(xiàn)天然的脫氧核酶。在 1994 年，Breaker 和 Joyce 運(yùn)用體外自然進(jìn)化過程（圖 1-1），篩選得到了兩個(gè)小型的 DNA 核酶，10-核酶，是具有裂解互補(bǔ) RNA 的磷酸二酯鍵功能的單鏈 DNA 分子在基因治療和基因功能研究，以及生物傳感器研究中。鑒于脫氧核潛力，脫氧核酶的篩選技術(shù)有了很大的發(fā)展。越來越多的新型脫氧[9,10]。陸藝課題組篩選到各種金屬離子-特異性的脫氧核酶，如 P導(dǎo)的的脫氧核酶[11,12]，最近他們又發(fā)現(xiàn)了一種新的脫氧核酶 NaA度 Na+下即顯示出良好的活性，可用于細(xì)胞內(nèi) Na+成像的生物傳感發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)依賴單價(jià)離子發(fā)揮催化活性的脫氧核酶。隨后，Liu了一種新的脫氧核酶 EtNa[14]，依賴 Na+發(fā)揮其催化裂解 RNA 的或者其他溶劑能加速其催化速率。另外，他們還篩選到了一系過渡的脫氧核酶[15,16]，例如依賴銀離子的脫氧核酶 Ag10C[17]。

貴州大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位論文aiti 課題組在 10-23 脫氧核酶識(shí)別臂上分別引入 2 個(gè) LNA 和 4 個(gè) LNA 形成新脫氧核酶(LNAzyme)來特異性沉默 miRNA hsa-miR-372 和 hsa-miR-373[25]。實(shí)結(jié)果表明無論在體內(nèi)或者在體外，經(jīng) LNA 修飾的 10-23 脫氧核酶，沉默活性到增強(qiáng)。并且具有四個(gè) LNA 修飾的 LNAzyme 表現(xiàn)出比具有兩個(gè) LNA 修飾的好的活性。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R91

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本文編號(hào)：2627319