【摘要】：癌癥嚴(yán)重影響人類的健康,是人類主要的死亡病因之一。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)的報(bào)告,預(yù)計(jì)到2030年全球癌癥患者病例將達(dá)到2220萬。目前治療癌癥的手段主要有手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療等,其中傳統(tǒng)的化學(xué)治療雖然取得一定的治療效果,但仍存在療效差、預(yù)后不良、毒副作用嚴(yán)重且易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)。癌癥的突出特征是癌細(xì)胞的生長不受控制,進(jìn)而破壞正常的組織及器官,使之功能紊亂、結(jié)構(gòu)受損,最終影響機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。近年來,藥學(xué)工作者針對癌癥發(fā)生發(fā)展中特異性表達(dá)的激酶、受體和細(xì)胞因子等研發(fā)新型靶向藥物,以提高藥物對癌細(xì)胞的選擇性、安全性和耐受性,降低毒性,保證臨床療效。Aurora激酶和血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)是兩類重要的癌癥靶標(biāo)分子。Aurora是一類絲/蘇氨酸激酶,在中心體復(fù)制、紡錘體形成和染色體分配等有絲分裂過程關(guān)系密切,并參與調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路。VEGFR2作為重要的酪氨酸激酶受體,可誘導(dǎo)腫瘤血管生成,促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移,參與調(diào)控Ras/Raf/MEK/ERK信號通路。目前,還沒有Aurora激酶抑制劑用于臨床治療。雖然VEGFR2抑制劑索拉非尼、吉非替尼等在臨床上有較好的應(yīng)用,但仍存在抗腫瘤譜較窄、易產(chǎn)生耐藥和毒副作用大等缺點(diǎn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),化合物C0129和C0198具有較好的Aurora激酶抑制活性和抗腫瘤活性。同時(shí)發(fā)現(xiàn),化合物C0129對VEGFR2也有顯著的抑制活性。因此,本論文將對這兩個(gè)化合物的體內(nèi)外抗腫瘤活性及作用機(jī)制進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究�；衔顲0129是一種穩(wěn)定氮氧自由基標(biāo)記的嘧啶類化合物,抑制Aurora A和VEGFR2的IC_(50)分別為0.061 nM和1.469 nM。CCK-8法測得化合物C0129對結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、肝癌細(xì)胞HepG2、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞HeLa和前列腺癌細(xì)胞PC-3等都有較強(qiáng)的增殖抑制活性,IC_(50)值分別為2.9?0.5μM、3.2?0.7μM、4.5?0.6μM、0.9?0.3μM和2.8?0.5μM,其中對HeLa細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng),對正常腎小球系膜細(xì)胞HRMC抑制不明顯。此外,EdU實(shí)驗(yàn)表明在HeLa細(xì)胞中C0129可明顯抑制細(xì)胞的DNA復(fù)制。在HeLa細(xì)胞中,一方面,通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C0129使紡錘體的形成受阻,影響細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程;細(xì)胞流式術(shù)和蛋白印跡分析發(fā)現(xiàn)C0129能夠調(diào)控周期蛋白cdc2和cyclinB1的活性,使HeLa細(xì)胞周期阻滯在G2/M期;C0129還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使BAD、Bax、caspase-3以及caspase-9促凋亡蛋白上調(diào),Bcl-2抑凋亡蛋白下調(diào),調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路的傳導(dǎo)。另一方面,C0129通過調(diào)控TGF-β、MMP2、MMP9和nm23-H1的表達(dá),抑制HeLa細(xì)胞的遷移;C0129還通過調(diào)控FAK、VE-cadherin、YB-1以及p38MAPK蛋白的表達(dá),減弱了HeLa細(xì)胞的侵襲能力。這些作用與C0129調(diào)控Ras/Raf/MEK/ERK信號通路有關(guān)。藥代動力學(xué)研究表明C0129單次口服給藥后其半衰期為4.12 h,達(dá)峰時(shí)間為4 h,而急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示其LD_(50)大于1000 mg/kg;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C0129在50 mg/kg時(shí),體內(nèi)對HeLa細(xì)胞移植瘤的抑瘤率為70%,高于VX680的50%;器官組織HE結(jié)果顯示C0129在體內(nèi)的毒性不明顯,和急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。綜合上述結(jié)果,證明化合物C0129是一種Aurora A激酶和VEGFR2激酶受體雙靶點(diǎn)抑制劑,體內(nèi)外均具有較好的抗腫瘤活性,且有較好的成藥性,具有進(jìn)一步開發(fā)研究的價(jià)值�；衔顲0198是一種酞嗪酮類Aurora激酶抑制劑,體外抑制Aurora A和Aurora B的IC_(50)分別為118 nM和80 nM;在細(xì)胞水平能明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116和LoVo、前列腺癌細(xì)胞PC-3、宮頸癌細(xì)胞HeLa和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的活性,CCK-8法測得IC_(50)值分別為0.83?0.2μM和2.2?0.7μM、1.75?0.6μM、3.2?0.5μM以及2.8?0.5μM;C0198對Aurora激酶高表達(dá)的HCT-116和PC-3腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性最顯著,而在正常腎小球系膜細(xì)胞HRMC中的毒性較小。在HCT-116細(xì)胞和PC-3細(xì)胞中,C0198通過阻滯細(xì)胞有絲分裂停滯在G2/M期,最終抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。C0198對腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控與它抑制Aurora A和Aurora B的活性直接相關(guān)。一方面,C0198通過抑制Aurora A在Thr288位的磷酸化,使Aurora A對CDC25B在Ser353位的磷酸化激活減弱,降低了CDC25B對cdc2/CyclinB1的調(diào)控作用;C0198通過抑制Aurora A的活性,使中心體的功能異常,導(dǎo)致紡錘體形成受阻,而微管蛋白是紡錘體的基本構(gòu)成。另一方面,C0198通過抑制Aurora B在Thr232位的磷酸化,影響著絲粒的功能,引起染色體缺失和損壞,使染色體正常復(fù)制和分配紊亂,從而使紡錘絲連接并牽拉姐妹染色體的分離異常,最終染色體不能有序分配到子細(xì)胞中去,使細(xì)胞有絲分裂停滯在G2/M期。因此,C0198阻滯腫瘤細(xì)胞周期在G2/M期誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡是抑制Aurora A和Aurora B激酶活性的結(jié)果。此外,體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)和藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,C0198的LD_(50)大于1000 mg/kg,半衰期為21 h,達(dá)峰時(shí)間為1.6 h,說明機(jī)體對C0198的吸收較快。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C0198抑瘤作用顯著,在HCT-116細(xì)胞移植瘤模型中,90 mg/kg C0198的抑制率為75%,高于VX680的60%;在PC-3細(xì)胞移植瘤模型中,90 mg/kg C0198的抑制率為66%,高于VX680的55%。組織器官HE結(jié)果顯示,C0198對機(jī)體的器官損傷不明顯,該結(jié)果和急性毒性結(jié)果一致。綜上所述,C0198作為Aurora激酶泛抑制劑,在細(xì)胞水平和體內(nèi)移植瘤水平均有顯著的抗腫瘤活性,并且毒性較低,成藥性較強(qiáng),有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值�？傊�,本論文對本課題組發(fā)現(xiàn)的兩種激酶抑制劑的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究,為進(jìn)一步研究開發(fā)奠定了較好的基礎(chǔ)。
【圖文】：

究者致力于研究靶向蛋白激酶的抑制劑，從而阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，達(dá)到目的。 Aurora 蛋白激酶1 Aurora 蛋白激酶結(jié)構(gòu)Aurora激酶是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，于1988年在對果蠅參與有絲體功能研究中被發(fā)現(xiàn)[13]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Aurora激酶在人類腫瘤組織中也有表Aurora激酶結(jié)構(gòu)包括309~403個(gè)氨基酸的序列。根據(jù)氨基酸序列的不ora激酶分為Aurora A、Aurora B 和 Aurora C 三種亞型，這三個(gè)亞型的度相似，均含有一個(gè)N-端調(diào)控區(qū)和一個(gè)C-端催化區(qū)以及一個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域包含有活性催化T環(huán)和降解盒，且ATP腺嘌呤環(huán)結(jié)合位點(diǎn)的殘基也（圖1-1）。但三種亞型在細(xì)胞分裂中卻呈現(xiàn)出完全不同且互不重疊的功能

最多。在中心體上，Aurora A 被 LIM 蛋白家族的 ajuba 蛋心體的復(fù)制和分離，使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期�；罨� Aurora粒蛋白，包括 tubulin，TACC 等到微管形成中心（MTOCs），[17]。因此，AuroraA 激酶與 G2/M 期阻滯和轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，它胞周期 G2/M 期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并激活 G2/M 期檢查]。因此，Aurora A 的異常表達(dá)可擾亂正常的有絲分裂，同時(shí)能3 是重要的抑癌基因。此外，在細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程中，核膜在roraA 被激活，然后通過 TPX2 靶向作用于微管，進(jìn)行紡錘體的錘體微管構(gòu)象形成，，TPX2 作為微管相關(guān)蛋白，在細(xì)胞周期的用，它能夠保護(hù) Aurora A 蛋白激酶不被水解，同時(shí)，Aurora2 的活性，共同維護(hù)紡錘體的組裝和細(xì)胞周期進(jìn)行[19]。在此過以與 Borealis(Bora)結(jié)合，對紡錘體的組裝及穩(wěn)定起調(diào)節(jié)作用響 Bora 的活性，調(diào)控有絲分裂進(jìn)程[20]。AuroraA 可以通過激
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2626256