【摘要】：隨著人口數(shù)量的不斷增加,生態(tài)環(huán)境遭到破壞,導(dǎo)致環(huán)境中二氧化碳釋放量不斷的增加,最終全球變暖、臭氧空洞大量形成。因此,紫外線大量的透過(guò)空洞,輻射到地球表面。紫外線中的中波長(zhǎng)紫外線UVB是主要造成皮膚損傷的紫外線,可以引起皮膚的光老化,造成皮膚損傷。所以保護(hù)皮膚免受UVB對(duì)皮膚的老化成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究以?xún)煞N羅非魚(yú)皮肽TGAGT和LSGTGP為材料,研究其抑制UVB(UltravioletB)誘導(dǎo)HaCaT角質(zhì)細(xì)胞光老化的機(jī)制。以不同劑量的UVB輻射HaCaT細(xì)胞,通過(guò)噻唑藍(lán)比色法(MTT)篩選出導(dǎo)致細(xì)胞半數(shù)致死量劑量為30 mJ/cm~2,建立了細(xì)胞損傷模型;通過(guò)MTT法證實(shí)兩種羅非魚(yú)皮肽TGAGT和LSGTGP在10-100μM的濃度范圍內(nèi)沒(méi)有細(xì)胞毒性,并證實(shí)該濃度范圍內(nèi)有對(duì)UVB輻射后的細(xì)胞活力提高的作用。將兩種羅非魚(yú)皮肽分別作用于HaCaT細(xì)胞4h再經(jīng)UVB輻射后培養(yǎng)24h,DNA氧化損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種羅非魚(yú)皮肽對(duì)UVB輻射后的細(xì)胞氧化損傷的DNA具有保護(hù)作用;DCFH-DA法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種羅非魚(yú)皮肽對(duì)UVB輻射細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生起到抑制作用,蛋白免疫印跡法(WB)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種羅非魚(yú)肽可以增加Glu和SOD含量的表達(dá),維持細(xì)胞內(nèi)抗氧化的水平;兩種羅非魚(yú)皮肽保護(hù)由UVB輻射后的HaCaT細(xì)胞,通過(guò)WB結(jié)果表明兩種肽經(jīng)過(guò)UVB輻射后,HaCaT細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路中,p38、JNK和ERK蛋白表達(dá)量增加,當(dāng)細(xì)胞經(jīng)羅非魚(yú)皮肽TGAGT保護(hù)后,磷酸化的p38和JNK蛋白表達(dá)量下降。然而,對(duì)ERK的磷酸化沒(méi)有起到抑制性作用。隨著羅非魚(yú)皮肽LSGTGP的濃度升高,磷酸化的p38、JNK和ERK蛋白表答逐漸減少;WB實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明經(jīng)兩種肽保護(hù)后再UVB輻射后,磷酸化的p65和IκB蛋白的表達(dá)降低。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種羅非魚(yú)皮肽TGAGT和LSGTGP保護(hù)的HaCaT細(xì)胞,隨著肽濃度的增加,細(xì)胞中p65的入核情況逐漸減弱,這一結(jié)果直觀的說(shuō)明了兩種羅非魚(yú)皮肽能夠抑制由UVB輻射HaCaT細(xì)胞p65的入核,抑制p65的表達(dá);ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩種肽可以降低受UVB輻射后HaCaT細(xì)胞MMP-1和MMP-9的分泌,減少了MMP-1和MMP-9的過(guò)度表達(dá),使其不能對(duì)膠原蛋白過(guò)度的降解,因此對(duì)膠原起到了保護(hù)作用。同時(shí),兩種羅非魚(yú)魚(yú)皮肽還可以提高I型膠原蛋白的含量,提高I型膠原蛋白自我的修復(fù)能力。因此,兩種羅非魚(yú)皮肽TGAGT和LSGTGP可以減緩因UVB輻射造成的皮膚損傷,對(duì)UVB造成的皮膚光老化起到保護(hù)的作用;因此,兩種羅非魚(yú)皮肽可以抑制通過(guò)ROS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激,及其介導(dǎo)的MAPK和NF-κB信號(hào)通路,進(jìn)而控制細(xì)胞中的MMPs并提高細(xì)胞中膠原蛋白的含量,具有抑制UVB誘導(dǎo)HaCaT角質(zhì)細(xì)胞的光老化作用。
【圖文】：

圖 1-1 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線Fig 1-1 Experimental technical route1.8 本課題研究的目的和意義魚(yú)類(lèi)廢棄物是蛋白質(zhì)，肽和氨基酸的重要來(lái)源，具有開(kāi)發(fā)新型營(yíng)養(yǎng)保健品的巨大潛力，可替代或?qū)⒑铣伤幬锏臐撛谟泻ψ饔米钚』�。此外，使用這種技術(shù)可以達(dá)到雙重目的，即從廉價(jià)和豐富的原料開(kāi)發(fā)高附加值產(chǎn)品，并最大限度地減少魚(yú)類(lèi)廢物的污染潛力。在過(guò)去幾十年中，關(guān)于魚(yú)類(lèi)副產(chǎn)品回收及其潛在生物活性的知識(shí)大大增加。盡管如此，需要更多的研究來(lái)更好地理解魚(yú)類(lèi)副產(chǎn)物蛋白質(zhì)水解物發(fā)揮其生物活性的機(jī)制。此外，必須進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)研究以回答它們?cè)跈C(jī)體中的吸收和生物利用度的問(wèn)題，以開(kāi)發(fā)用于人類(lèi)功能性食品的營(yíng)養(yǎng)保健品和針對(duì)多種疾病的天然藥物的食品添加劑。本課題的研究，通過(guò)查閱大量關(guān)于羅非魚(yú)魚(yú)皮多肽的相關(guān)文獻(xiàn)，選取兩種羅非魚(yú)魚(yú)皮肽 TGAGT 和 LSGTGP[124-125]，并根據(jù)序列進(jìn)行合成。并對(duì)其跟蹤分析兩種樣品是否具備抑制光老化的作用，研究其活性機(jī)制。為預(yù)防 UVB 誘導(dǎo)皮膚光老化的海洋

圖 2-1 UVB 輻射對(duì) HaCaT 細(xì)胞相對(duì)活力的影響Fig 2-1 Effect of UVB radiation on the relative viability of HaCaT cells性實(shí)驗(yàn)種羅非魚(yú)皮肽 TGAGT 和 LSGTGP 的毒性進(jìn)行檢測(cè)，分別的濃度為 10、20、50 和 100 μM 的兩種肽培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MT 法檢測(cè)細(xì)胞活力，，結(jié)果如圖 2-2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種羅SGTGP 濃度在 10、20、50 和 100 μM 時(shí)，與空白組相比，加樣力不受影響，表示在該濃度范圍內(nèi)，兩種樣品不具有細(xì)胞毒性進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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