【摘要】：腫瘤嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康,目前對(duì)腫瘤的主要治療方法有手術(shù)治療、化學(xué)治療和放射治療。腫瘤光動(dòng)力學(xué)治療(Photodynamic therapy,PDT)是在特定激發(fā)光的照射下,光敏劑(Photosensitizer,PS)將能量高效轉(zhuǎn)移至氧氣,產(chǎn)生活性氧(ROS)殺死癌細(xì)胞的治療方法,因其治療的溫和性、非侵入性以及副作用小等優(yōu)點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。但腫瘤PDT仍存在著一些問(wèn)題,如多數(shù)PS水溶解性差、小分子光敏劑難以穿過(guò)體內(nèi)的重重生物學(xué)屏障,難以實(shí)現(xiàn)在其作用靶點(diǎn)的高效分布、光敏毒性、腫瘤微環(huán)境降低PDT效率等,因此腫瘤PDT治療效率的提高及光敏毒性的降低是目前PDT亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。目前腫瘤PDT研究主要集中在PS的腫瘤靶向轉(zhuǎn)運(yùn)、PDT治療腫瘤的作用機(jī)制以及與其它治療方式的協(xié)同作用等�；诖�,本課題擬構(gòu)建一種基于分子識(shí)別作用的腫瘤細(xì)胞激活的PDT體系,在提高腫瘤PDT效率的同時(shí),采用分子激活“開(kāi)關(guān)”的理念,降低PDT的光敏毒性。近年來(lái)二氧化錳(MnO_2)因其粒徑可控,具有ROS猝滅作用,可與還原性谷胱甘肽(GSH)反應(yīng),催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生氧氣等性質(zhì)越來(lái)越多的用于藥物納米載體的研究。第二代PS,血卟啉單甲醚(HMME),性質(zhì)比較穩(wěn)定,光敏化力強(qiáng)且毒性低及在機(jī)體內(nèi)代謝比較迅速等優(yōu)點(diǎn),在臨床上被廣泛用于腫瘤的PDT。特定序列的核酸適配體(Aptamer,APT)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向作用。為使PDT體系具有“開(kāi)關(guān)”效應(yīng),本研究利用介孔二氧化錳納米粒(MMnNPs)對(duì)PS的高效ROS產(chǎn)生猝滅作用,構(gòu)建PDT的“開(kāi)關(guān)”,為實(shí)現(xiàn)PDT體系腫瘤特異性激活,我們采用兼具分子識(shí)別及構(gòu)象變化能力的發(fā)卡狀A(yù)PT作為PDT體系“開(kāi)關(guān)”的智能“感應(yīng)器”。該P(yáng)DT體系在正常組織時(shí),發(fā)卡狀A(yù)PT無(wú)識(shí)別作用,不能發(fā)生構(gòu)象變化,HMME不能成功釋放,處于MMnNPs中,此時(shí)為猝滅狀態(tài),避免光敏毒性;在腫瘤組織時(shí),發(fā)卡狀A(yù)PT識(shí)別MCF-7細(xì)胞表面的MUC-1蛋白,構(gòu)象發(fā)生變化,HMME釋放,此時(shí)由于腫瘤中高濃度的過(guò)氧化氫,在載體二氧化錳的催化下產(chǎn)生自由氧,為ROS的產(chǎn)生提供氧氣來(lái)源,同時(shí),MnO_2消耗細(xì)胞內(nèi)的GSH,減少其對(duì)產(chǎn)生的ROS的影響,掃清腫瘤PDT的上下游障礙,高效治療腫瘤。本課題采用超聲重結(jié)晶的方法實(shí)現(xiàn)MMnNPs高效裝載HMME,載藥率高達(dá)88.7%,將能與乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞表面的標(biāo)志物膜蛋白(MUC-1)互補(bǔ)的,連接巰基的發(fā)卡狀A(yù)PT作為門(mén)控分子封堵MMnNPs的孔道,同時(shí)實(shí)現(xiàn)靶向MCF-7細(xì)胞及智能激活PDT的特性,對(duì)該制劑(MMnNPs/HMME-DNA)進(jìn)行表征,考察了其形態(tài)、粒徑電位、XPS、孔徑以及作為“開(kāi)關(guān)型”材料的可行性等。TEM結(jié)果表明MMnNPs粒徑均勻,200 nm左右;XPS結(jié)果表明Mn離子的價(jià)態(tài)為+4價(jià);通過(guò)氮?dú)馕娇芍狹nO_2比表面積為123.9982 m2/g、平均孔徑為3.23039 nm,孔徑大小合適,具有裝載藥物的能力;通過(guò)對(duì)HMME產(chǎn)生ROS的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MnO_2對(duì)HMME產(chǎn)生ROS具有猝滅作用;藥物釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,只有在MUC-1蛋白存在時(shí),孔道才能被打開(kāi),HMME才能釋放。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表明已成功構(gòu)建具有開(kāi)關(guān)特性的MMnNPs/HMME-DNA。選用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,正常乳腺細(xì)胞Hs578Bst為對(duì)照實(shí)驗(yàn)組,對(duì)MMnNPs/HMME-DNA腫瘤PDT體系在532 nm激光照射下進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究。結(jié)果表明,載體材料MnO_2在使用劑量下對(duì)兩種細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用,而制劑對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明顯,對(duì)Hs578Bst細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。與游離HMME相比,MMnNPs/HMME-DNA組對(duì)MCF-7的生長(zhǎng)抑制作用顯著提高;攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MCF-7細(xì)胞中MMnNPs/HMME-DNA組在細(xì)胞質(zhì)中有很強(qiáng)的紅色熒光分布,表明MMnNPs/HMME-DNA可在MCF-7細(xì)胞中釋放出HMME,而Hs578Bst細(xì)胞中紅色熒光微弱,說(shuō)明HMME不能在Hs578Bst細(xì)胞中釋放;凋亡實(shí)驗(yàn)對(duì)比制劑組MCF-7和Hs578Bst,結(jié)果表明MCF-7組凋亡率明顯高于Hs578Bst組,而HMME組兩種細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差別,說(shuō)明所制備的制劑對(duì)MCF-7和Hs578Bst具有較好的選擇性;從檢測(cè)細(xì)胞GSH含量變化可以看出,該載體系統(tǒng)可以降低細(xì)胞內(nèi)GSH的含量,用于改善腫瘤的治療。在體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)中,選用MCF-7對(duì)裸鼠構(gòu)建荷瘤裸鼠模型動(dòng)物,主要對(duì)MMnNPs/HMME-DNA進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性考察。組織分布與游離IR783組相比,MMnNPs/HMME/IR783-DNA組能延長(zhǎng)IR783在裸鼠體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,具有較好的靶向作用,使IR783高效聚集在腫瘤部位;免疫熒光結(jié)果表明MnO_2可以在一定程度上改善腫瘤缺氧的狀況;體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,基于MMnNPs/HMME-DNA的“開(kāi)關(guān)型”P(pán)DT體系能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng),效果明顯優(yōu)于游離HMME給藥組;TUNEL凋亡研究結(jié)果進(jìn)一步證明了該給藥系統(tǒng)能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng),對(duì)腫瘤組織細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡的作用;對(duì)腫瘤組織GSH的含量進(jìn)行檢測(cè),與生理鹽水組對(duì)比,結(jié)果表明腫瘤組織GSH的含量降低接近50%。綜上所述,MMnNPs/HMME-DNA腫瘤PDT體系的體內(nèi)外研究結(jié)果表明,APT使該P(yáng)DT體系實(shí)現(xiàn)了“開(kāi)關(guān)可控”以及HMME在腫瘤組織的特異性釋放,在激光照射下能高效產(chǎn)生ROS,特異性殺傷腫瘤細(xì)胞,有望應(yīng)用于腫瘤治療。
【圖文】：

圖 1. 1 MMnNPs/HMME-DNA 作用示意圖Fig 1.1 The schematic diagram of MMnNPs/HMME-DNA interaction

圖 2. 1 MMnNPs 的合成示意圖Fig 2.1 The schematic illustration of MnO2nanocomposite preparation3.2 載體 MMnNPs 的表征結(jié)果3.2.1 透射電子顯微鏡結(jié)果（TEM）圖 2.2 為載體材料 MMnNPs 的透射電鏡圖，從 TEM 圖中可以看到 MnO2呈球形，邊緣不規(guī)則，結(jié)構(gòu)疏松，有明顯介孔結(jié)構(gòu)，為藥物的裝載提供基礎(chǔ)，且MnO2納米粒的粒徑均勻，，200 nm 左右，具有 EPR 效應(yīng)，此納米載體的介孔結(jié)構(gòu)可用于藥物的裝載，因此該納米�？勺鳛樗幬镙d體。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R943

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2605316