【摘要】：研究背景:2,4’,5’-三羥基-5,2’-二溴二苯甲酮(LM49)是課題組在對海藻多酚類化合物進行結構優(yōu)化的過程中,得到的新型多酚結構化合物。動物實驗證實LM49可明顯改善急性腎盂腎炎大鼠的腎功能,增加大鼠血清中的抗炎因子IL-10的含量,降低炎癥因子IL-1β和IL-6的含量,表明了LM49對細菌性炎癥具有抗炎作用。但是,具體的抗炎機制尚不明確,RAW264.7細胞為體外研究炎癥反應的靶細胞,因此本文主要探討LM49對RAW264.7巨噬細胞的影響,從而明確LM49發(fā)揮抗炎作用的分子機制。目的:鑒于巨噬細胞的極化參與機體調控炎癥反應的進程,本課題旨在探討LM49抗炎活性與巨噬細胞極化的關系,且通過體內與體外實驗評價LM49對巨噬細胞極化的影響,并初步探討LM49調控巨噬細胞極化的機制。方法:第一部分多酚化合物LM49對LPS+INF-γ誘導的RAW264.7巨噬細胞極化的影響1.MTT法檢測LM49對RAW264.7細胞活力的影響。2.Griess法檢測LM49對LPS+INF-γ誘導的RAW264.7巨噬細胞分泌NO產量的影響。3.流式細胞術檢測LM49對LPS+INF-γ誘導的RAW264.7巨噬細胞膜表面分子CD16/32和CD206表達的影響。4.Western-blot檢測LM49對LPS+INF-γ誘導的RAW264.7巨噬細胞分泌i NOS和Arg-1蛋白表達的影響。5.RT-PCR檢測LM49對LPS+INF-γ誘導的RAW264.7巨噬細胞Arg-1、i NOS、CD206、CD86、CD163、FIZZ、IL-6、TNF-α、IL-10、MCP-1和IL-12 m RNA表達的影響。第二部分LM49對LPS+INF-γ誘導的RAW264.7巨噬細胞極化機制的初步探討1.RT-PCR檢測LM49對LPS+INF-γ誘導的RAW264.7細胞IRF-4、IRF-5、KLF4、SOCS1、SOCS3、NF-κB、STAT1、STAT3、STAT6、TLR4、Myd88、JAK1、JAK2和JAK3 m RNA表達的影響。2.Western-blot檢測LM49對LPS+INF-γ誘導的RAW264.7細胞TLR4、Myd88和NF-κB蛋白表達的影響。3.Western-blot檢測LM49對LPS+INF-γ誘導的RAW264.7細胞SOCS1、JAK2、p-JAK2、STAT1和p-STAT1蛋白表達的影響。4.Western-blot檢測LM49對LPS+INF-γ誘導的RAW264.7細胞JAK1、p-JAK1、JAK3、p-JAK3、STAT6和p-STAT6蛋白表達的影響。第三部分LM49對LPS誘導的急性肝損傷中肝臟Kuffer細胞極化的影響1.微孔法檢測LM49對LPS誘導的急性肝損傷小鼠血清中的AST和ALT活力的影響,ELISA檢測小鼠血清中的IL-6和TNF-α含量的影響。HE染色檢測LM49對LPS誘導的急性肝損傷小鼠的肝臟組織炎癥反應的影響。2.免疫組化檢測LM49對LPS誘導的急性肝損傷小鼠肝臟組織中Arg-1的表達影響,流式細胞術檢測肝臟巨噬細胞(KCs)中CD16/32和CD206的表達。3.Western-blot和RT-PCR檢測LM49對LPS誘導的急性肝損傷小鼠的KCs細胞中i NOS和Arg-1表達水平的影響。結果:1.LM49在0~30μmol·L-1濃度下對RAW264.7細胞無明顯毒性,后續(xù)實驗選擇的劑量為5μmol·L-1,10μmol·L-1,20μmol·L-1。LM49呈劑量依賴性的抑制LPS+INF-γ誘導的RAW264.7細胞上清液中NO的表達。LM49顯著抑制i NOS的蛋白表達和誘導Arg-1的蛋白表達,且呈一定的劑量依賴性。2.LM49抑制LPS+INF-γ誘導的RAW264.7細胞M1型標志物CD16/32的表達和誘導M2型標志物CD206的表達,且呈劑量依賴性;LM49抑制LPS+INF-γ誘導的RAW264.7細胞中i NOS、IL-6、TNF-α、CD86、MCP-1和IL-12的m RNA表達,誘導Arg-1、CD206、CD163、FIZZ和IL-10 m RNA的表達。3.LM49抑制LPS+INF-γ誘導的RAW264.7細胞中IRF-5、JAK2、SOCS3、STAT1、TLR4、Myd88和NF-κB m RNA的表達,上調細胞中IRF-4、KLF4、SOCS1、JAK1、JAK3和STAT6 m RNA的表達,但是,對STAT3 m RNA的表達沒有明顯的促進作用。4.LM49抑制LPS+INF-γ誘導的RAW264.7細胞中TLR4、Myd88和NF-κB蛋白的表達;LM49的高劑量組顯著增加細胞中SOCS1的表達,抑制細胞中JAK2、p-JAK2、STAT1和p-STAT1蛋白的表達;LM49上調RAW264.7細胞中JAK1、p-JAK1、JAK3、p-JAK3、STAT6和p-STAT6蛋白的表達。5.LM49可以顯著降低LPS誘導的急性肝損傷小鼠血清中的AST和ALT的活性,對血清中的炎癥因子IL-6和TNF-α也有顯著的抑制作用。病理切片顯示,LM49可明顯減少LPS誘導的急性肝損傷小鼠肝臟中炎性細胞浸潤。6.免疫組化結果顯示,LM49可以顯著性增加肝臟中M2標志物Arg-1的表達;流式結果顯示,LM49可以顯著性的增加M2標志物F4/80+CD206+細胞數(shù)目,減少了M1標志物F4/80+CD16/32+細胞數(shù)目;RT-PCR和Western-blot結果顯示,LM49可以顯著增加肝臟KCs細胞中Arg-1的表達,降低了KCs細胞中i NOS的表達。結論:1.LM49對LPS聯(lián)合INF-γ誘導的M1型巨噬細胞有顯著的抑制作用,同時可促進巨噬細胞向M2型極化。2.LM49通過對TLR4-Myd88-NF-κB和JAK2-STAT1通路的負向調控作用抑制M1型巨噬細胞極化;通過對JAK1/JAK3-STAT6通路的正向調控作用促進M2型巨噬細胞極化。3.LM49對LPS誘導的急性肝損傷小鼠具有肝臟保護作用,可能通過其促進肝臟巨噬細胞向M2型極化發(fā)揮其抗炎作用。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學碩士學位論文以均數(shù)±標準差（ X±SD）來表示。采用 graphpad p驗及 One-way ANOVA 比較各組內及組間差異。P <義。所有實驗均重復進行 3 次。2 結 果 RAW264.7 巨噬細胞活力的影響 所示，，LM49 作用于 RAW264.7 細胞 24 h 后，在 0～264.7 細胞無明顯毒性。在后續(xù)實驗中，LM49 的

LPS+INF-γ誘導 RAW264.7 細胞上清液中 NO 的含量的影響 control 組（##P < 0.01），LM49 組 vs LPS/INF-γ組（*P < 0.0 LPS+INF-γ誘導的 RAW264.7 細胞膜表面分達的影響所示，LPS+INF-γ組與空白組比，可顯著誘導 RAW；而 LM49 組與 LPS+INF-γ組相比，可顯著抑制 L胞中 CD16/32 的表達，同時誘導 RAW264.7 中 CD2量依賴性。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2598909