【摘要】：神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子,具有促進(jìn)神經(jīng)元胞體存活、軸突定向再生和髓鞘生成的作用。目前,國際上通用的NGF活性測定方法主要有雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法和大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株(PC12細(xì)胞)培養(yǎng)法兩種。傳統(tǒng)的雞胚背根神經(jīng)節(jié)法比較經(jīng)典,但方法操作比較繁瑣,檢測結(jié)果易受實驗操作人員主觀判斷的影響,只能用作定性和半定量評價。PC12細(xì)胞培養(yǎng)法是基于NGF對PC12細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用。PC12細(xì)胞膜上有NGF受體,受生理水平NGF的誘導(dǎo),PC12細(xì)胞停止分裂,長出神經(jīng)突起,分化成具有交感神經(jīng)元特性的細(xì)胞。分化的PC12細(xì)胞量與NGF活性間具有一定線性關(guān)系,可用于評價NGF的活性。 本論文的目的是建立并優(yōu)化用PC12細(xì)胞測定NGF活性的檢測方法。主要包括：(1)PC12細(xì)胞培養(yǎng)方法的優(yōu)化。包括NGF的稀釋倍數(shù)、細(xì)胞的接種密度、細(xì)胞懸液的清洗次數(shù)、細(xì)胞的培養(yǎng)時間、染色液的染色時間。實驗結(jié)果表明：在無血清培養(yǎng)條件下,NGF倍比稀釋,最佳細(xì)胞接種密度為(3-4)*104／孔,最佳清洗次數(shù)為2次,最佳培養(yǎng)時間為48h,最佳染色時間為4h。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)方法分別測定了兩個不同生產(chǎn)批次的NGF生物活性,變異系數(shù)均小于15%。(2)方法學(xué)驗證。對優(yōu)化后的PC12細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行了方法學(xué)驗證,包括方法準(zhǔn)確性、精密度、線性測定范圍、抗干擾能力等�？垢蓴_能力主要考察輔料甘露醇和人血白蛋白對NGF活性的影響。實驗結(jié)果表明,本論文建立的改良PC12細(xì)胞培養(yǎng)法用于注射用鼠NGF活性分析,方法抗干擾能力強,輔料對NGF活性測定沒有明顯影響；方法準(zhǔn)確度與精密度良好,回收率為80%-120%,變異系數(shù)10%；線性測定范圍較寬1-100AU/ml,線性回歸方程為：y=-0.873/[1+(x/17.977)2.092]+1.350。對多批次武漢海特生產(chǎn)的注射用鼠NGF活性測定結(jié)果表明,所建立的方法實用性良好。
【圖文】：

培養(yǎng)時間為48h,染色時間為4h,考察細(xì)胞接種密度對PC12細(xì)胞檢測NGF活性方法的影響。不同細(xì)胞密度下所測得的吸光值如表5所示，四參數(shù)曲線擬合如圖5所示，檢測結(jié)果顯示：細(xì)胞濃度在2xl05/ml時所的的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)好，曲線平滑，各點分布均勻，曲線更為典型，故細(xì)胞濃度選擇2xl05/ml來進(jìn)行活性測定。表5不同細(xì)胞接種密度下的吸光值NGF劑量 細(xì)胞1X1 OVml 細(xì)胞2x 1 oVml 細(xì)胞3x 1 oVmlAU/ml 平均吸光值 平均吸光值 平均吸光值200 1.109 1.385 1.396100 1.098 1.377 1.33350 0.981 1.239 1.31225 0.548 0.981 1.02312.5 0.318 0.548 0.7816.25 0.254 0.318 0.5703.125 0.219 0.211 0.4941.5625 0.109 0.201 0.3120.7813 0.065 0.198 0.16522

細(xì)胞180^11，培養(yǎng)時間為48h，，染色時間為4h,考察細(xì)胞清洗次數(shù)對PC12細(xì)胞檢測NGF活性方法的影響。不同清洗次數(shù)下所測得的吸光值如表6所示，四參數(shù)曲線擬合如圖6所示，檢測結(jié)果顯示：清洗2次和3次，其相關(guān)系數(shù)都達(dá)標(biāo)，但是細(xì)胞清洗3次的細(xì)胞狀態(tài)不及清洗2次的狀態(tài)好，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線信噪比較差，故對細(xì)胞清洗2次作為實驗條件的確立。表6不同細(xì)胞清洗次數(shù)下的吸光值NGF劑量AU/ml 細(xì)胞清洗2次平均吸光值 細(xì)胞清洗3次平均吸光值24
【學(xué)位授予單位】：湖北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R927.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 林萬敏,凌文海,劉建平,張卓兵,殷明,謝毅;對大鼠PC12細(xì)胞用于定量測定神經(jīng)生長因子活性兩種方案的評價[J];復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版);1998年02期

2 鄧小華,羅學(xué)港;神經(jīng)生長因子受體TrkA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)、分布和作用[J];國外醫(yī)學(xué).神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊;2000年01期

3 劉少平,楊國成,孟祥平,夏臘菊,朱漢民;小鼠頜下腺2.5S神經(jīng)生長因子生物活性評估標(biāo)準(zhǔn)的建立[J];廣西醫(yī)學(xué);2005年01期

4 陳素蘭,李曉光,于肇英;背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分離培養(yǎng)法評價神經(jīng)生長因子的生物活性[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;1993年04期

5 俞萍,趙強,柳川,王會信;神經(jīng)生長因子體外生物學(xué)活性測定國際標(biāo)準(zhǔn)方法的初步建立[J];中國生化藥物雜志;1999年04期

6 駱鵬;譚亞軍;田霖;張庶民;;PC12細(xì)胞體外培養(yǎng)法測定蛇毒神經(jīng)生長因子活性[J];中國生物制品學(xué)雜志;2006年05期

7 董躍偉,黃玉輝,徐天瑞;雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法測定神經(jīng)生長因子(NGF)活性的條件優(yōu)化[J];蛇志;2004年04期

8 熊仁平，周元國，寧可;神經(jīng)生長因子的生物活性研究[J];藥物生物技術(shù);1996年03期

9 方煌,吳洋管,龐清江,袁太珍,羅永湘,劉海雄,林娜;從牛精漿中提純神經(jīng)生長因子的生物活性檢測[J];中國修復(fù)重建外科雜志;1993年01期

本文編號：2597744