發(fā)布時(shí)間：2020-03-22 05:33

【摘要】：目的：研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清對正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）各淋巴細(xì)胞亞群比例的影響；探究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清對誘導(dǎo)活化后的PBMC殺傷腫瘤細(xì)胞功能的影響。 方法: 一．人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究。 利用組織塊貼壁法分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并利用傳代純化篩選出能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的hUC-MSC；倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測hUC-MSCs的免疫表型；應(yīng)用不同因子誘導(dǎo)hUC-MSCs向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化并進(jìn)行鑒定。 二． hUC-MSCs對正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）各淋巴細(xì)胞亞群比例的影響的研究。 通過密度梯度離心法分離PBMC，加入OKT3刺激，，用含有hUC-MSCs培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基（MSC-CM）處理PBMC， FCM分析比較處理組和對照組各淋巴細(xì)胞亞群比例以及周期的變化；Annexin V/PI雙染確定PBMC的凋亡情況；ELISA法檢測MSC-CM對PBMC分泌IFN-γ、IL-10的影響。 三． PGE2參與hUC-MSCs對Treg亞群比例的調(diào)節(jié)并影響PBMC的增殖活性。 在hUC-MSCs的培養(yǎng)體系中加入PGE2拮抗劑NS-398并收集培養(yǎng)2~3d后的hUC-MSC上清。用含此時(shí)收集的hUC-MSC上清的條件培養(yǎng)基作用于PBMC，作為實(shí)驗(yàn)組，用含未處理過的hUC-MSCs培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基作用于PBMC，作為對照組1，用正常DMEM/F12培養(yǎng)基作用于PBMC，作為對照組2。FCM分析比較實(shí)驗(yàn)組和各對照組PBMC中Treg比例的變化；ELISA法檢測比較實(shí)驗(yàn)組和各對照組PBMC分泌IFN-γ、IL-10的水平。 四． hUC-MSCs上清與CIK及腫瘤細(xì)胞A549共培養(yǎng)體系的相互作用研究。 密度梯度離心法分離PBMC，并誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測CIK細(xì)胞免疫表型；流式細(xì)胞術(shù)檢測hUC-MSCs培養(yǎng)上清作用后A549細(xì)胞周期的變化，MTT法檢測A549細(xì)胞增殖曲線；MTT法檢測hUC-MSCs培養(yǎng)上清對CIK殺傷A549細(xì)胞的影響。 結(jié)果：成功分離得到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)細(xì)胞貼壁、呈長梭形，形態(tài)均一，高表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD73、CD105、CD44、CD29和黏附分子CD90，不表達(dá)CD14、MHCⅡ類分子HLA-DR和造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD45，Gomori鈣鈷法、油紅O染色和阿利辛藍(lán)染色證實(shí)分離所得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞；MSC-CM下調(diào)了CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，上調(diào)了PBMC中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的含量，而對其他淋巴細(xì)胞亞群的比例無顯著影響，抑制了PBMC分泌IFN-γ的能力，但對IL-10的分泌有促進(jìn)作用，此外，MSC-CM對PBMC有保護(hù)作用，降低了PBMC在OKT3刺激下的凋亡程度。抑制劑NS-398的加入使MSC-CM上調(diào)Treg的能力下降，同時(shí)也抑制了上調(diào)PBMC分泌IL-10的能力，且使PBMC分泌IFN-γ的水平得到恢復(fù)，NS398抑制試驗(yàn)確定了PGE2是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的介導(dǎo)因子；殺傷試驗(yàn)證實(shí)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對CIK的殺傷功能具有抑制作用，且此抑制作用可能被血清中和。 結(jié)論：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)可不依賴于與免疫細(xì)胞的直接或間接接觸，并且與誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡無關(guān)，通過可溶性因子PGE2促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖和活化可能是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮其免疫抑制功能的途徑之一，且此種抑制效應(yīng)能夠降低CIK細(xì)胞對肺腺癌A549細(xì)胞的殺傷功能。
【圖文】：

3 結(jié)果3.1 hUC-MSCs 的分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察通過組織塊法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，可在分離培養(yǎng)的 10d 內(nèi)于倒置顯下觀察到呈梭行、多角形或短桿狀的貼壁細(xì)胞從組織塊周圍爬出（圖 1.A）。10胞增長速度逐漸加快，向遠(yuǎn)離組織塊方向呈放射狀生長，細(xì)胞逐增生為形態(tài)均

圖 2. hUC-MSCs 的免疫表型檢測Fig2. The test of immunophenotype of hUC MSCs hUC-MSCs 的分化潛能和鑒定.1 向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)及其鑒定在成骨定向誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，觀察到誘導(dǎo)細(xì)胞體積逐漸增大，細(xì)胞間隙逐漸細(xì)胞形態(tài)逐漸由長梭形向短梭形、鱗片型、多角形等形態(tài)轉(zhuǎn)變，且常伴有短相連，輪廓清晰，多位于細(xì)胞的游離端。誘導(dǎo)后期可觀察到細(xì)胞中部出現(xiàn)結(jié)，部分細(xì)胞層疊生長，細(xì)胞胞漿中形成大小不一的顆粒沉積，而對照組仍為形細(xì)胞形態(tài)，胞漿中也無顆粒沉積（圖 3.A）。經(jīng) Gomori 鈣鈷法染色顆粒會到棕黑色（圖 3.B），大部分細(xì)胞染色呈陽性，符合成骨細(xì)胞的特征，由此我分離所得 hUC-MSCs 具有向成骨細(xì)胞分化的能力。.2 向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)及其鑒定在成脂定向誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)加入成脂誘導(dǎo)液后細(xì)胞幾乎停止增長，5
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;Transplantation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Ameliorates the Autoimmune Pathogenesis in MRL/lpr Mice[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年06期

2 肖燕妮;張曦;劉耀;張根玲;曾鈺竹;苗瑩瑩;李忠俊;;臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療GVHD的效果(附5例異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后GVHD的治療)[J];中國輸血雜志;2013年04期

本文編號：2594569