發(fā)布時(shí)間：2020-03-19 18:51

【摘要】：目前,人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)由人血液提取,由于來源有限滿足市場(chǎng)的需求,且人血來源極其復(fù)雜,可能存在血源污染等潛在威脅,因此,迫切需要一種安全可靠、成本相對(duì)低廉的HSA替代品。基于快速發(fā)展的基因重組技術(shù),可利用該技術(shù)來生產(chǎn)重組人血清白蛋白(recombinant human serum albumin,rHSA),由于該技術(shù)能夠克服傳統(tǒng)方法存在的血源供應(yīng)不足以及血源污染等缺陷,目前已經(jīng)成為研究和生產(chǎn)rHSA的重點(diǎn)技術(shù)。由于臨床用藥和生化研究對(duì)轉(zhuǎn)基因豬血中分離純化出的rHSA的要求較高,因此,如何分離純化rHSA成為研究是關(guān)鍵。本研究中建立了一種從豬血中獲得高純度和高收率的rHSA分離純化方法,為規(guī)�；闹苽鋜HSA奠定基礎(chǔ)。本文由四章組成。第一章前言部分對(duì)HSA和rHSA進(jìn)行了概述,簡(jiǎn)單介紹了幾種常見的白蛋白的純化方法,并提出了本課題的研究目標(biāo)與意義。第二章,首先采用低溫乙醇沉淀法的改良方法—熱乙醇沉淀法對(duì)豬血漿中rHSA進(jìn)行粗提取。我們考察并優(yōu)化了熱乙醇沉淀法中反應(yīng)體系pH、加熱溫度、恒溫反應(yīng)時(shí)間和稀釋倍數(shù)等主要影響因素對(duì)rHSA提取效果的影響。由反相高效液相色譜色譜(RP-HPLC)純度表征結(jié)果可知,在pH6.5,65℃、40 min以及2倍稀釋倍數(shù)的最優(yōu)反應(yīng)條件下,rHSA純度從豬血漿中的9.3%提高到熱乙醇沉淀法的69.5%。第三章,我們考察了陽離子、陰離子、陽-陰離子相結(jié)合和陰-陽離子交換色譜相結(jié)合的方法對(duì)熱乙醇沉淀粗純化后rHSA進(jìn)行精純化的效果,并對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明采用陰離子交換色譜法,對(duì)熱乙醇沉淀法粗純化的rHSA進(jìn)行精純化,能達(dá)到最佳的純化效果,所得產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC純度表征結(jié)果為85.0%。第四章,為了進(jìn)一步提高純度,采用兩種路線(反相色譜(路線一)和凝膠色譜法(路線二))對(duì)陰離子交換色譜法純化后的rHSA進(jìn)行二次精純化。RP-HPLC表征結(jié)果,反相色譜和凝膠色譜法的產(chǎn)物純度均達(dá)到了100.0%。經(jīng)HPLC-MS/MS表征,兩種路線得到產(chǎn)物的純度分別約為97.33%和93.77%,總回收率分別約為41.1%和38.6%。盡管熱乙醇沉淀-陰離子-反相色譜(路線一)的純度和回收率相對(duì)于熱乙醇沉淀-陰離子-凝膠色譜法(路線二)均較高,但反相色譜的流動(dòng)相中有機(jī)溶劑可能會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)蛋白發(fā)生變性,可能會(huì)破環(huán)蛋白的結(jié)構(gòu)從而限制了此純化路線的應(yīng)用;而凝膠色譜法采用的是低濃度鹽緩沖液,條件更加溫和,利于保持蛋白在純化過程中的穩(wěn)定,更適用于rHSA的純化,因此最終采用路線二作為最終轉(zhuǎn)基因豬血中rHSA的純化方案。所建立的方法有望從轉(zhuǎn)基因豬血中提取出高純度rHSA,以實(shí)現(xiàn)其更廣泛的應(yīng)用。
【圖文】：

圖 1-1 人血清白蛋白的分子的三維結(jié)構(gòu)圖1. The three-dimensional structure of human serum albumin mo成與代謝首先合成 HSA 的前體（prepro HSA），接著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

26圖 2-1 不同 pH 值條件下，熱乙醇沉淀法提取的 rHSA 純度表征的反相色. 2-1 Purity characterization of rHSAafter thermal ethanol precipitation at differa reversed-phase liquid chromatography
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R914;Q78

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本文編號(hào)：2590573