【摘要】：活性小分子探針是靶標(biāo)識(shí)別的重要工具,在新藥靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和靶蛋白特異性識(shí)別中具有重要意義。本論文設(shè)計(jì)合成了兩類功能性小分子探針:光親和探針和熒光探針。光親和探針含有功能性的光親和基團(tuán)和純化基團(tuán),能夠在光照條件下特異性與靶標(biāo)共價(jià)結(jié)合,并通過(guò)純化基團(tuán)對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行分離和富集。熒光探針含有功能性的熒光基團(tuán),能夠在分子水平上對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行識(shí)別、定位。天然產(chǎn)物(-)-arctigenin及其類似物在L6骨骼肌細(xì)胞水平上表現(xiàn)出顯著的促葡萄糖攝取活性,動(dòng)物水平的評(píng)價(jià)表明具有明顯的降糖效果。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)其是AMPK信號(hào)通路的激動(dòng)劑,但直接作用靶標(biāo)未知。對(duì)這類化合物的構(gòu)效關(guān)系研究確定優(yōu)勢(shì)母核,并發(fā)現(xiàn)A環(huán)間位氨基上芐基取代的化合物保持了良好的促葡萄糖攝取活性。采用原位標(biāo)記的策略,在芐基上進(jìn)行了二吖丙啶類和二苯甲酮類光親和基團(tuán)的引入,通過(guò)多樣性的結(jié)構(gòu)改造,獲得了活性保持的光親和探針2P14(1.789@1.5μM),并進(jìn)行了靶標(biāo)垂釣的工作。利用P14與L6骨骼肌細(xì)胞共孵育,使其與靶蛋白有效結(jié)合;紫外光照激發(fā)光敏基團(tuán),使其與靶蛋白共價(jià)偶聯(lián);利用銅催化的Huisgen環(huán)化反應(yīng),在靶蛋白上引入生物素;采用鏈親和素柱對(duì)靶蛋白進(jìn)行富集濃縮;對(duì)濃縮的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分離純化,并選取特異性條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定;數(shù)據(jù)分析處理獲得了三個(gè)與能量代謝相關(guān)的蛋白P06576、E9PN89和P81605,進(jìn)一步的工作還在進(jìn)行中。同時(shí)為了對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行細(xì)胞定位,設(shè)計(jì)合成了10個(gè)熒光探針,但是未獲得活性探針。在探針2P14的靶標(biāo)垂釣實(shí)驗(yàn)中,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了摸索和細(xì)節(jié)優(yōu)化,建立了靶標(biāo)垂釣實(shí)驗(yàn)的整體流程和條件優(yōu)化的方法。在活性光親和探針的設(shè)計(jì)中,合成了結(jié)構(gòu)多樣性的光親和基團(tuán)11種,利用光親和基團(tuán)庫(kù),快速獲得了選擇性抗肝癌Yhhu-258類化合物的高活性光親和探針3P5(IC50=153 nM)。在活性熒光探針的合成中,發(fā)現(xiàn)了一類合成簡(jiǎn)便、結(jié)構(gòu)新穎的BODIPY類熒光淬滅探針,對(duì)這類探針進(jìn)行結(jié)構(gòu)-熒光性質(zhì)考察發(fā)現(xiàn):1.苯胺是熒光淬滅必須的;2.苯胺上給電子基的取代有利于熒光淬滅,吸電子取代不利于熒光淬滅,說(shuō)明熒光是通過(guò)PIET過(guò)程淬滅的;3.探針對(duì)熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的空間距離具有一定敏感性,增大這兩個(gè)基團(tuán)的空間位阻可以顯著增強(qiáng)熒光。利用探針的這三點(diǎn)性質(zhì),設(shè)計(jì)合成了Aβ識(shí)別探針4P28,對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)與Aβ纖維具有高親和力(Kd=3.5 nM),能有效染色轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片中的老年斑。同時(shí),首次發(fā)現(xiàn)探針4P28能夠在染色后不清洗的條件下,高對(duì)比度的觀察老年斑,這是目前其他的探針難以實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步我們?cè)O(shè)計(jì)合成了NIR類探針4P36,對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型體內(nèi)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),在尾靜脈注射給藥后5-45 min,其頭部熒光標(biāo)記信號(hào)是野生型小鼠的2倍,初步證明探針可用于診斷AD發(fā)病,深入的研究還在進(jìn)行中。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R91;R914
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本文編號(hào)：2586550