【摘要】：神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)元損傷是神經(jīng)系統(tǒng)常見病。此類疾病的預(yù)后與神經(jīng)細胞的存活、神經(jīng)元分化和功能恢復(fù)密切相關(guān),亦與相關(guān)基因表達的激活或抑制有關(guān)。拓撲異構(gòu)酶Ⅱβ(TopoisomeraseⅡβ,TopoⅡβ)是促進神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元分化的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是從傘形科藁本屬植物川芎中分離提純的一種活性生物堿,化學(xué)名2,3,5,6-四甲基吡嗪。最近有研究報道了其對神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化有促進作用,但其確切作用機制尚不明了。本研究以人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞為神經(jīng)元分化模型,用TMP誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化,并檢測細胞分化過程中TopoⅡβ的表達變化;進而探討TMP誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的分子機制。為TMP在神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)研究與治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。本研究共分三部分。第一部分川芎嗪對SH-SY5Y細胞生長特性的影響和神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)作用目的:研究TMP對SH-SY5Y細胞生長狀況的影響,以及誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化的作用。方法:1、細胞培養(yǎng):SH-SY5Y細胞以DMEM培養(yǎng)基,置飽和濕度和37℃于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、MTT法檢測SH-SY5Y細胞體外增殖活性,繪制細胞生長曲線。3、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放實驗:不同濃度的TMP處理1~5天,測定LDH釋放百分率評價TMP的細胞毒性。4、細胞周期和凋亡率檢測:分別在TMP作用0,3和5天收集細胞,流式細胞術(shù)分析G0/G1、S和G2/M期細胞百分比,并檢測凋亡率。5、細胞核DAPI染色:分別在TMP作用0,1,3和5日進行DAPI染色,觀察細胞核形態(tài)。6、Caspase-3活性檢測:SH-SY5Y細胞以80μmol/L TMP作用0,1,3和5天后收集細胞,檢測樣品Caspase-3的活性。7、細胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測:不同濃度的TMP誘導(dǎo)分化,分別在0~5天觀察、測量各組細胞突起長度的變化。以單個細胞總突起長度大于100μm作為細胞分化標(biāo)準(zhǔn),計算細胞分化百分率。8、免疫印跡(Western blot)檢測神經(jīng)元分化標(biāo)志蛋白MAP2、tau的表達和p21蛋白的表達。9、統(tǒng)計學(xué)方法:實驗結(jié)果以x±s表示,單因素方差分析(One-Way ANOVA),P0.05為有顯著性意義。結(jié)果： 1 MTT檢測TMP對SH-SY5Y細胞體外增殖的影響在各個時間點,20μmol/L TMP對SH-SY5Y細胞增殖無明顯影響(P0.05)。細胞分別在40,80,120,160,320和400μmol/L TMP作用下,增殖受到抑制(P0.05)。隨著TMP濃度的增高和培養(yǎng)時間的延長,其對細胞增殖的抑制逐漸增加。提示TMP對SH-SY5Y細胞增殖的抑制作用具有濃度和時間依賴性。2 LDH釋放實驗檢測TMP的細胞毒性40,80和120μmol/L TMP分別處理SH-SY5Y細胞。在1、3和5天檢測LDH釋放百分率,與對照細胞比較,均顯示無明顯差異(P0.05)。160μmol/L TMP作用5天LDH釋放比率分別為16.1±1.50%,和對照組11.2±1.20%相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。240μmol/L TMP作用1、3和5天,LDH釋放比率分別為14.5±2.00%,16.6±2.00%,19.5±3.32%,對照組分別為11.7±1.34%,11.1±1.56,11.2±1.20%,有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。上述結(jié)果表明,低濃度TMP(40,80和120μmol/L)對SH-SY5Y細胞無明顯細胞毒性。3 TMP對細胞周期分布和凋亡的影響SH-SY5Y細胞在80μmol/L處理0、3和5天,與對照組細胞相比較G0/G1期細胞增多,表明發(fā)生G0/G1期阻滯(P0.05)。與對照細胞向比,TMP可引起細胞周期抑制因子(G0/G1抑制蛋白)p21蛋白的表達升高(P0.05)。80μmol/L TMP處理細胞在0,1,3和5天,檢測2倍體峰前均未發(fā)現(xiàn)明顯凋亡峰;DAPI染色觀察細胞核形態(tài),細胞核表現(xiàn)形態(tài)完整,均未見凋亡小體等凋亡特征性改變。TMP處理后,Caspase-3活性和active-Caspase-3蛋白表達無明顯變化(P0.05)。顯示80μmol/L TMP在誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞神經(jīng)元分化中未導(dǎo)致細胞凋亡。4細胞分化形態(tài)學(xué)變化和分化百分率TMP誘導(dǎo)組細胞出現(xiàn)增殖速度下降,細胞逐漸伸出突起;且突起的數(shù)量和長度明顯增加。對單個細胞平均神經(jīng)突起長度測量,結(jié)果顯示:在20μmol/L TMP作用下,SH-SY5Y細胞突起長度和分化百分率改變不明顯(P0.05)。而40μmol/L誘導(dǎo)2天,細胞突起開始出現(xiàn)明顯增長,與對照細胞比較有顯著性差異(P0.05)。80μmol/L和120μmol/L TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞后,細胞神經(jīng)突起長度和分化百分率均較對照細胞明顯增長,且均比40μmol/L誘導(dǎo)后突起長度增加明顯(P0.05)。5神經(jīng)元分化的鑒定采用神經(jīng)元分化標(biāo)志分子,微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)和tau蛋白鑒定神經(jīng)元分化。SH-SY5Y細胞經(jīng)80μmol/L TMP誘導(dǎo)0,3和5日后MAP2和tau蛋白表達增高,與對照組細胞相比有明顯差異(P0.05)。結(jié)論:80μmol/L TMP誘導(dǎo)可使SH-SY5Y細胞脫離細胞周期,并向神經(jīng)元分化;且未見明顯的細胞毒性。因此,本研究選用80μmol/L TMP誘導(dǎo)神經(jīng)元分化,并繼續(xù)用于后繼機制研究。第二部分川芎嗪上調(diào)TopoⅡβ誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞分化的表觀遺傳學(xué)機制目的:檢測TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞分化過程中,TopoⅡβ的表達變化及其表觀遺傳學(xué)機制。方法:1、細胞培養(yǎng):SH-SY5Y細胞以DMEM培養(yǎng)基,置飽和濕度和37℃于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、細胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測:用80μmol/L TMP誘導(dǎo)分化,分別在0~5天觀察和測量細胞平均突起長度,以單個細胞突起總長度大于100μm作為細胞分化標(biāo)準(zhǔn),計算細胞分化百分率。3、Western blot檢測TopoⅡα、TopoⅡβ、組蛋白H3、H4、乙�；M蛋白H3(acetylated histone H3,Ac-H3)和乙酰化組蛋白H4(acetylated histone H4,Ac-H4)的表達。4、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測TopoⅡβm RNA表達。5、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)檢測Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的募集與結(jié)合。6、統(tǒng)計學(xué)方法:同第一部分。結(jié)果:1 Western blot檢測TopoⅡβ和TopoⅡα蛋白的表達與對照細胞比較,TMP誘導(dǎo)分化細胞的TopoⅡα蛋白表達在第3天和第5天均明顯減少(P0.05);而TopoⅡβ蛋白表達則明顯增加(P0.05)。2 RT-PCR檢測TopoⅡβmRNA表達與對照細胞相比,TopoⅡβm RNA的表達在TMP誘導(dǎo)分化的第3天和第5天均表現(xiàn)為增加(P0.05)。3 ICRF-193拮抗TMP誘導(dǎo)TopoⅡβ表達和神經(jīng)元分化TopoⅡβ抑制劑ICRF-193作用后,TopoⅡβ和MAP2蛋白表達受到抑制(P0.05);神經(jīng)突起數(shù)量和長度均明顯下降(P0.05)。表明TopoⅡβ與神經(jīng)元分化呈正相關(guān)。4 TMP誘導(dǎo)組蛋白H3和H4出現(xiàn)過乙�；疉c-H3的表達在TMP誘導(dǎo)分化的第3天和第5天逐漸增加(P0.05);而Ac-H4的表達在TMP誘導(dǎo)分化的第5天明顯增加(P0.05)。提示Ac-H3與Ac-H4均可被TMP誘導(dǎo)表達,而Ac-H3表達升高相對較早。5 TMP增強Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的結(jié)合著誘導(dǎo)分化時間的延長,特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的Ac-H3與Ac-H4逐漸增高(P0.05)。Ac-H3在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的結(jié)合早于Ac-H4。提示Ac-H3發(fā)揮作用早于Ac-H4。結(jié)論:TMP誘導(dǎo)神經(jīng)元分化作用與TopoⅡβ表達的上調(diào)有關(guān)。TMP促進Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的募集而誘導(dǎo)TopoⅡβ高表達,是促進神經(jīng)元分化的重要機制。第三部分PI3K/Akt信號通路參與川芎嗪誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞神經(jīng)元分化目的:探討TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中,PI3K/Akt和ERK1/2信號通路對TopoⅡβ表達和神經(jīng)元分化的影響及機制。方法:1、細胞培養(yǎng):SH-SY5Y細胞以DMEM培養(yǎng)基,置飽和濕度和37℃于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、細胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測:用80μmol/L TMP誘導(dǎo)細胞分化。分別在0~5天測量計算細胞平均突起長度,以單個細胞總突起長度大于100μm作為分化標(biāo)準(zhǔn),計算細胞分化百分率。3、Western blot檢測蛋白質(zhì)表達。4、RT-PCR檢測TopoⅡα和TopoⅡβm RNA表達。5、Ch IP檢測轉(zhuǎn)錄因子Sp1與NF-YA在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的結(jié)合。6、統(tǒng)計學(xué)方法:同第一部分。結(jié)果:1 TMP對p-Akt、p-ERK1/2、TopoⅡα、TopoⅡβ、Sp1和NF-YA蛋白表達的影響80μmol/L TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞分化0,1,3和5天。TopoⅡα蛋白的表達逐漸減少,TopoⅡβ蛋白表達逐漸增多;p-Akt的表達逐漸升高(P0.05),p-ERK1/2表達無明顯變化(P0.05);Sp1的表達逐漸增高(P0.05),而NF-YA蛋白表達無明顯變化(P0.05)。2 PI3K/Akt抑制劑LY294002對p-Akt,TopoⅡα、β、Sp1和NF-YA蛋白表達的影響應(yīng)用LY294002后,80μmol/L TMP誘導(dǎo)細胞分化5天,TopoⅡα蛋白的表達減少,且不受LY294002的影響;TopoⅡβ和Sp1蛋白表達和p-Akt的表達受到明顯抑制(P0.05)。p-ERK1/2和NF-YA蛋白的表達無明顯變化(P0.05)。3 LY294002抑制TMP誘導(dǎo)的神經(jīng)突起的發(fā)生和神經(jīng)元分化標(biāo)志蛋白的表達TMP誘導(dǎo)第5天,應(yīng)用LY294002后,TMP誘導(dǎo)細胞的突起長度由150.97±6.62μm下降為91.80±7.82μm(P0.05),細胞分化百分率由80.04±3.26%下降為46.20±33.56%(P0.05)。而MEK/ERK抑制劑U0126對細胞形態(tài)、細胞突起長度和分化百分率均未產(chǎn)生明顯作用(P0.05)。經(jīng)LY294002處理細胞后,神經(jīng)元分化標(biāo)志蛋白MAP2的表達受到明顯抑制(P0.05)。而U0126對MAP2蛋白表達未產(chǎn)生明顯抑制作用。表明PI3K/Akt信號通路參與了TMP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞分化。4 LY294002對TMP誘導(dǎo)TopoⅡα和TopoⅡβm RNA表達的影響TMP可上調(diào)TopoⅡβm RNA的表達,而抑制TopoⅡαm RNA的表達。與TMP誘導(dǎo)組相比較,加入PI3K/Akt抑制劑LY294002作用后,TopoⅡβm RNA的表達下調(diào)(P0.05),而TopoⅡαm RNA的表達無明顯改變(P0.05)。分別應(yīng)用蛋白質(zhì)合成抑制劑亞胺環(huán)己酮(Cycloheximide,CHX)和RNA聚合酶II抑制劑鵝膏菌素(α-amanitin)預(yù)處理SH-SY5Y細胞后檢測TopoⅡβm RNA的表達,結(jié)果顯示:α-amanitin(50μg/m L)可明顯降低TMP誘導(dǎo)的TopoⅡβm RNA的表達,而CHX(10 mmol/L)則對其表達無明顯影響。表明TMP上調(diào)TopoⅡβ的表達發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,并且與PI3K/Akt信號途徑的激活有關(guān)。5 TMP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Sp1和NF-YA在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)結(jié)合Ch IP檢測顯示,TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞向神經(jīng)元分化過程中,Sp1蛋白特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動子GC盒,促進了TopoⅡβ的轉(zhuǎn)錄表達。而加入PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002作用后,結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的Sp1蛋白受到明顯抑制(P0.05)。轉(zhuǎn)錄因子NF-Y的亞型NF-YA在神經(jīng)分化后期與TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的結(jié)合也呈現(xiàn)增高(P0.05),而LY294002對NF-YA與TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的結(jié)合沒有明顯影響(P0.05)。結(jié)果提示PI3K/Akt/Sp1/TopoⅡβ信號途徑參與了TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞向神經(jīng)元分化。結(jié)論:TMP誘導(dǎo)神經(jīng)元分化過程中,PI3K/Akt信號被激活;轉(zhuǎn)錄因子Sp1受到PI3K/Akt通路的調(diào)控;Sp1與TopoⅡβ基因啟動子區(qū)結(jié)合,促進TopoⅡβ基因的轉(zhuǎn)錄激活。PI3K/Akt/Sp1/TopoⅡβ信號途徑參與了TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞向神經(jīng)元分化。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
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本文編號：2562870